Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Gluconobacter oxydans Stammes für die Biotransformation von Glucose zu 5-Keto-D-Gluconat (5-KGA). Es wurde im ersten Schritt ein geeigneter Stamm ausgewählt, der die höchsten 5-KGA Ausbeuten erreichte. G. oxydans besitzt für die Oxidation von Glucose zu 5-KGA ein cytosolisches System aus NADP-abhängigen Dehydrogenasen und ein System aus Membran-assoziierten, PQQ-abhängigen Dehydrogenasen.

Durch Insertionsmutagenese des mga2dh-Gens, welches in G. oxydans für eine membrangebundene, FAD-abhängige Gluconat-2-Dehydrogenase (mGA2DH) kodiert, konnte die Bildung des Nebenproduktes 2-Keto-D-Gluconat unterbunden werden. Zur Steigerung der 5-KGA-Produktivität, wurde dann das Gen für die cytosolische Gluconat:NADP 5-Oxidoreduktase (GNO) homolog überexprimiert, wodurch 5-KGA Konzentrationen von 200 mM erzielt wurden. Die Regeneration des Cofaktors NADP konnte durch heterologe Coexpression des Gens der cytosolischen Pyridinnukleotid Transhydrogenase (UDHA) aus E. coli gesteigert werden.

Untersuchungen des Membran-assoziierten Systems in G. oxydans zeigten die Bedeutung der PQQ-abhängigen Gluconat-5-Dehydrogenase (mGA5DH) bei der 5-KGA-Bildung. Nach der Inaktivierung der mGA5DH verblieb eine Restaktivität der 5-KGA-Bildung von 20 %, die der cytosolischen GNO zuzuordnen war. Damit wurde die mGA5DH als das Enzym identifiziert, welches in G. oxydans primär für die 5-KGA-Bildung verantwortlich ist.

Zur weiteren Verbesserung der 5-KGA-Produktivität wurden anschließend sowohl das Gen der membrangebundenen, PQQ-abhängigen Glucose-Dehydrogenase (mGDH) als auch das Gen der Gluconat-5-Dehydrogenase (mGA5DH) homolog in G. oxydans überexprimiert. Ein Austausch des mga5dh-Promotors des Gluconat-5-Dehydrogenase Gens gegen den tufB-Promotor des Elongationsfaktors (EF-Tu) aus G. oxydans resultierte in einer weiteren Steigerung der 5-KGA-Konzentration (300 mM).

Um die Glucosekonzentration bei der Biotransformation möglichst niedrig zu halten, wurde ein fed-batch Verfahren entwickelt, was zu einer weiteren Steigerung der 5-KGA-Bildung führte. Das gebildete Produkt konnte durch Zugabe von CaCl2 als Ca(5-KGA)2-Salz in nahezu reiner Form isoliert werden.

The aim of this work was a rational strain development of the acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans DSM 2343 for whole-cell-biotranformation of glucose to 5-keto- D-gluconic acid (5-KGA), a precursor of L-(+)-tartaric acid.

G. oxydans exhibits two separately localised enzyme systems for the oxidation of glucose to 5-KGA. On the one hand, there is a system of pyrrolochinoline-quinonedependent (PQQ) dehydrogenases which are orientated to the periplasmatic space. On the other hand, there are cytosolic, NADP-dependent oxidoreductases which perform the oxidation of glucose to 5-KGA, too.

Besides the favoured oxidation product 5-KGA, G. oxydans was also able to accumulate the undesired structural isomer, 2-keto-D-gluconic acid (2-KGA). By inserting a gene-sequence of a kanamycine-resistance protein into the chromosomal part of the gluconate-2-dehydrogenase (mGA2DH), the formation of 2-KGA was completely prevented. This action led to an increase in the total 5-KGA-formation rate and final concentration, respectively.

By homologues overexpression of the cga5dh-gene, which encodes for a cytosolic NADP-dependent gluconate-5-dehydrogenase (cGA5DH), the 5-KGA concentration could be enhanced by 20%, as compared to the wild-type. To ensure the availability of the necessary cofactor NADP, the gene for a transhydrogenase (UDHA) of E. coli was heterologously coexpressed thus guaranteeing the reoxidation of NADPH via NAD and the respiratory chain.

By inactivating the mga5dh-gene it could be demonstrated that the membrane-bound gluconate-5-dehydrogenase (mGA5DH) was the enzyme mainly responsible for 5-KGA formation. The resulting mutant strain showed a basal 5-KGA formation of 20% as compared to the wild-type strain. Exchanging the native promoter of the mga5dh-gene against the stronger tufB and mgdh-promoter led to an increase of the 5-KGA formation activity and the final 5-KGA concentration. Finally, a 5-KGA production strain could be developed, which showed an enhanced final 5-KGA concentration (300 mM), which was 20-fold higher than that of the wild-type strain.