Dokument: Zellextraktfreie Amplifikation der pathologischen Konformation des Prionproteins

Titel:	Zellextraktfreie Amplifikation der pathologischen Konformation des Prionproteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3456
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20060710-001456-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Weinmann, Nicole [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	neurodegenerative Erkrankungen, Proteinfehlfaltung, Prionen, Prionprotein, Scrapie, Amplifikation, amyloide Fibrillen, ThioflavinT-Test
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Prionen sind die Erreger neurodegenerativer Erkrankungen, die nicht nur infektiöser, sondern auch sporadischer oder genetischer Natur sein können. Sie besitzen keine codierende Nukleinsäure, und ihr Hauptbestandteil ist das wirtseigene Prionprotein (PrP), das in zwei chemisch identischen Isoformen auftritt, der zellulären Form, PrPC, und der krankheitsassoziierten Form, PrPSc. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften sind jedoch unterschiedlich. PrPC weist eine überwiegend α-helikale Sekundärstruktur auf, ist in milden Detergenzien löslich und sensitiv gegenüber Proteinase K- (PK-) Verdauung. PrPSc hingegen weist einen erhöhten Anteil an β-Faltblattstruktur auf, bildet unlösliche Aggregate, die amorpher oder fibrillärer Struktur sein können, und besitzt eine partielle Resistenz gegenüber PK-Verdauung. Als bestes Replikationsmodell gilt, dass die Ausbildung von Prionkrankheiten durch die Konversion von PrPC in die infektiöse Isoform PrPSc hervorgerufen wird. Alle bisher zugelassenen Diagnoseverfahren für Prionkrankheiten beruhen auf dem Nachweis des PK-resistenten Anteils von PrPSc. Dadurch kann die Krankheit jedoch erst diagnostiziert werden, wenn PrPSc in großer Menge im erkrankten Organismus vorliegt. Ziel dieser Arbeit war es, ein System zu entwickeln, welches den natürlichen Replikationsmechanismus in vitro nachstellt. Damit sollten die im Fall einer Erkrankung vorhandenen PrPSc-Aggregate in vitro vermehrt, und dadurch der Nachweis geringster Mengen an PrPSc ermöglicht werden. Gleichzeitig sollte ein Einblick in den Replikationsmechanismus erhalten werden. Der Amplifikationsprozess sollte als keiminduzierte Anlagerung von PrPC an vorhandene PrPSc-Aggregate, gefolgt von der Konversion von PrPC in die pathogene Isoform, etabliert und systematisch untersucht werden. Durch die Verwendung aufgereinigter Komponenten zur Etablierung dieses Systems wäre ein Diagnoseverfahren im Routinestil möglich. Es wurde ein in unserer Arbeitsgruppe bereits entwickeltes in vitro-Konversionssystem zur Bildung fibrillärer Aggregate aus PrPC verwendet. Durch die Zugabe von PrPSc als Keim konnte jedoch die Ausbildung der Fibrillen von einem Zeitraum von einigen Wochen auf einige Stunden beschleunigt werden. Fibrillogeneseansätze in Anwesenheit von PrPSc konnten eindeutig von entsprechenden Negativkontrollen unterschieden werden. Als Nachweismethoden wurden differentielle Ultrazentrifugation, Thioflavin T (ThT)-Test, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), Circular Dichroismus (CD) und Elektronenmikroskopie (EM) benutzt. Der ThT-Test erwies sich quantitativ als besonders geeignet, während EM und FCS zum Verständnis des Mechanismus beitrugen. Anhand des etablierten Systems wurde des Weiteren der Einfluss der Monomer-, sowie der Keimkonzentration auf die keiminduzierte Fibrillogenese detailliert untersucht. Eine zusätzliche Sensitivitätssteigerung des etablierten Systems zur Vermehrung von PrPSc-Aggregaten gelang durch die Einführung einer Ultraschallbehandlung der Proben. Das ursprüngliche Modell der zyklischen Aufeinanderfolge von Keimbildung und Wachstum konnte vollständig bestätigt werden. Das etablierte System bildet die Grundlage zum Aufbau eines sensitiven Diagnoseverfahrens.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	10.07.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	06.07.2006
Datum der Promotion:	06.07.2006