Dokument: Identifizierung und Charakterisierung neuer Adhäsine bei Chlamydia trachomatis

Titel:	Identifizierung und Charakterisierung neuer Adhäsine bei Chlamydia trachomatis
Weiterer Titel:	Identification and characterization of new adhesins of Chlamydia trachomatis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34545
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150612-151608-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Stallmann, Sonja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 20,31 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.06.2015 / geändert 10.06.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chlamydien sind gramnegative, obligat intrazelluläre Bakterien. Zu den bedeutendsten hu-manpathogenen Spezies zählen Chlamydia trachomatis und C. pneumoniae. C. trachomatis ist der weltweit häufigste bakterielle Erreger sexuell übertragbarer Krankheiten und ruft Infektionen des Urogenitaltrakts hervor, welche unbehandelt zur Infertilität bei Frauen führen kann. An-dere Serovare dieses Pathogens können durch die Infektion des Auges die Bildung eines Trachoms verursachen, was noch immer die Hauptursache vermeidbarer Blindheit ist. C. pneumoniae führt zu akuten Infektionen der oberen und unteren Atemwege und weist eine altersabhängige Durchseuchung der Bevölkerung von bis zu 70 % auf. Die erfolgreiche Etablierung einer Infektion erfordert die Adhäsion und nachfolgende Inter-nalisierung des Bakteriums in die Wirtszelle. Initial erfolgt eine wahrscheinlich reversible Bin-dung von chlamydialem OmcB an polymere Zuckerstrukturen (Glykosaminoglykane) der Wirtszelloberfläche. Die folgende irreversible Bindung spezifischer chlamydialer Adhäsine, u.a. alle Mitglieder der polymorphen Membranprotein (Pmp) Familie, an humane Rezeptoren induziert die Aufnahme des Bakteriums. Nach simultaner Blockade des OmcB- und Pmp-vermittelten Adhäsionsweges bei C. pneumoniae konnte noch immer eine erhebliche Restinfek-tion beobachtet werden. Chlamydien scheinen demzufolge, wie andere Pathogene, multiple Adhäsionsstrategien entwickelt zu haben. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit neue Adhä-sine für C. trachomatis E, dem am weitest verbreiteten Serovar in Deutschland, identifiziert und charakterisiert werden. Eine genomweite Suche nach geeigneten Kandidaten wurde anhand von bioinformatorischen und literaturbasierten Kriterien durchgeführt. Die ausgewählten Kandidaten wurden in Ctad1 bis 12 umbenannt (C. trachomatis Adhäsin). Mit rekombinantem Protein erfolgte eingehend die Charakterisierung des Adhäsionsverhaltens und des Einflusses auf die chlamydiale Infektion. Fünf Proteine erfüllten diese Eigenschaften und wurden hinsichtlich ihrer genauen Funktion untersucht. Dazu wurden u.a. Ctad-spezifische Antikörper zur Analyse ihrer Lokalisation wäh-rend der chlamydialen Infektion generiert. Die Lokalisations- und Funktionsanalysen zeigten, dass Ctad2 und Ctad9 potentielle Effektor-proteine darstellen, während es sich bei Ctad4 wahrscheinlich um ein Haushaltsprotein und bei Ctad8 um ein Inklusionsmembranprotein handelt. Für Ctad1 konnte eine essentielle Funktion als chlamydiales Adhäsin im Infektionsprozess aufgezeigt werden. Ctad1 lokalisierte auf der Oberfläche von Bakterien, von der es durch Puf-ferbehandlung teilweise entfernt werden konnte. Rekombinantes Ctad1 (rCtad1) Protein ver-mittelte über zwei SH3-Domänen in seinem N-Terminus die konzentrationsabhängige Bin-dung an Humanzellen. Die Bindung korreliert mit der konzentrationsabhängigen Neutralisati-on der Infektion, die auf die Reduktion der Adhäsion infektiöser, chlamydialer Partikel zu-rückzuführen war. Ferner induzierte Ctad1 seine eigene Internalisierung in Humanzellen und kann daher auch als Invasin bezeichnet werden. Als humaner Interaktionspartner von Ctad1 konnte im Hefe-zwei-Hybrid-System die β1-Untereinheit des Integrin-Rezeptors ermittelt und mittels Far-Westernblot Analyse verifiziert werden. Eine 50 %ige Reduktion der C. trachomatis E Infektion auf Integrin-β1-negativen Zel-len bestätigte eine essentielle Funktion des Rezeptors in vivo. Die Infektionsreduktion korre-lierte mit einer signifikant reduzierten Adhäsion rCtad1-beschichteter Kügelchen an Zellen dieser Zelllinie. Mikroskopisch konnte in der frühen Infektion sowohl bei Zellen der HEp-2 Zelllinie als auch bei primären Eileiterepithelzellen eine Assoziation von Integrin-β1 an adhä-rierten EBs nachgewiesen werden. Die Bindung von C. trachomatis E und rCtad1 induzierte eine Signaltransduktion in die Humanzelle, die zur Aktivierung von ERK1/2 führte. Interessanterweise neutralisierte rCtad1 Protein auch die Infektion von C. trachomatis L2 und C. pneumoniae, was auf eine generelle Funktion des konservierten Proteins in der frühen chlamydialen Infektion hindeutet. Zusammenfassend konnte mit Ctad1 ein neues Adhäsin und Invasin von C. trachomatis Sero-var E beschrieben und als humaner Interaktionspartner die β1-Untereinheit des Integrin-Rezeptors identifiziert werden. Die Blockade der Ctad1 – Integrin-β1 Interaktion mit Inhibi-toren könnte neue Therapiemöglichkeiten eröffnen, um einer C. trachomatis Infektion entge-genzuwirken. Chlamydia are Gram-negative, obligate intracellular bacteria. The most significant human path-ogenic species are Chlamydia trachomatis and C. pneumoniae. C. trachomatis is the worldwide lead-ing cause of sexually transmitted diseases and induces infections of the urogenital tract, which when untreated lead to infertility in women. Other serovars of this pathogen infect the eyes causing trachoma, which is still the main cause of preventable blindness. C. pneumoniae leads to acute infection of the upper and lower respiratory tract with an age-related antibody prevalence of up to 70 %. The successful establishment of an infection requires adhesion and subsequent internalization of the bacteria into the host cell. Initially the reversible binding of chlamydial OmcB to poly-meric sugar structures (glycosaminoglycan) on the host cell surface takes place. The following irreversible binding of specific chlamydial adhesins, inter alia all members of the polymorphic membrane protein (Pmp) family, to human receptors induce uptake of the bacteria. After sim-ultaneous blocking of the OmcB and Pmp mediated adhesion by C. pneumoniae, a considerable infection could still be observed. Thus, it seems that Chlamydia like other pathogens have de-veloped multiple adhesion strategies. Therefore, the aim of this thesis was the identification and characterization of new adhesins from C. trachomatis Serovar E, being the leading chlamyd-ial pathogen in Germany. A genome-wide screen for candidates was performed with the help of bioinformatics and lit-erature-based criteria. The selected candidates have been renamed Ctad1 to Ctad12 (C. trachomatis adhesin). Using recombinant protein a first characterization of the adhesive properties and impact on the chlamydial infection was carried out. Five proteins satisfied these properties and their functions have been further studied. In addition, Ctad-specific antibodies were generated for analyzing their localization during chlamydial infection. The localization and functional analyzes revealed that Ctad2 and Ctad9 represent potential effector proteins, while Ctad4 can be regarded a housekeeping protein and Ctad8 an inclusion membrane protein. For Ctad1 an essential function as chlamydial adhesin in the infection process could be demonstrated. Ctad1 localized on the bacteria surface, from where it could be partially re-moved by buffer treatment. Recombinant Ctad1 (rCtad1) protein mediated dose-dependent adhesion to human cells by two SH3 domains in its N-terminus. The binding correlated with the dose-dependent neutralization of infection, which results from a reduced adhesion of the infectious, chlamydial particle. Furthermore, Ctad1 induced its own internalization into human cells and can therefore be referred to as invasin. As human interaction partner of Ctad1 the β1-subunit of the integrin-receptor could be identi-fied by yeast-two-hybrid and this was verified by far-western analyzes. A 50 % reduction in C. trachomatis E infection of integrin-β1-negative cells confirmed an essential function of the receptor in vivo. The reduced infection correlated with a significantly reduced adhesion of rCtad1-coated beads to cells of this cell line. Early in infection using HEp-2 cells or human primary fallopian tube epithelia cells an association of integrin-β1 with attached EB could be detected microscopically. Binding of C. trachomatis E and rCtad1 induced a signal transduction in human cells, which led to the activation of ERK1/2. Interestingly, recombinant Ctad1 protein also neutralized a C. trachomatis L2 and a C. pneumoniae infection, pointing to a general function of the conserved protein in early chla-mydia infection. In summary, Ctad1 could be described as a new adhesin and invasin of C. trachomatis serovar E with the β1-subunit of the integrin-receptor beeing identified as its human interaction partner. Interfering with the Ctad1 – integrin-β1 interaction using small inhibiters might provide new therapeutic possibilities to counteract a C. trachomatis infection.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	12.06.2015
Dateien geändert am:	12.06.2015
Promotionsantrag am:	26.03.2015
Datum der Promotion:	11.05.2015