Dokument: Spectroscopic investigations of [FeFe] hydrogenases and related model systems

Titel:	Spectroscopic investigations of [FeFe] hydrogenases and related model systems
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34484
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150608-132148-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Adamska-Venkatesh, Agnieszka [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 58,36 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.06.2015 / geändert 08.06.2015
Stichwörter:	EPR, FTIR, [FeFe] hydrogenases, metalloenzymes, mechanisms, hydrogen production
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	[FeFe]-Hydrogenasen sind Metalloenzyme, die die Oxidation von Wasserstoff sowie die Reduktion von Protonen zu Wasserstoff katalysieren. Das Verständnis des katalytischen Mechanismus und der Biosynthese von Hydrogenasen sowie ihrer elektronischen und geometrischen Struktur ist von großem Interesse für biotechnologische Prozesse. Hydrogenasen dienen als Modelle für die Entwicklung von Wasserstoff-umsetzenden Katalysatoren basierend auf erneuerbaren Energiequellen. Die aus Algen stammende [FeFe]-Hydrogenase aus dem Organismus Clamydomonas reinhardtii (CrHydA1) ist für die Untersuchung von Hydrogenasen besonders gut geeignet, da sie ausschließlich das aktive Zentrum und keine weiteren Eisen-Schwefel-Cluster enthält, welche für den Elektronentransport in von Bakterien abstammenden Hydrogenasen verantwortlich sind. Das aktive Zentrum wird als „H-Cluster“ bezeichnet und besteht aus einem „klassischen“ [4Fe-4S]-Cluster, verbunden über den Schwefel einer Cystein-Gruppe mit der ungewöhnlichen [2Fe]H-Untereinheit, welche CO und CN- Liganden sowie einen verbrückenden Dithiolat-Liganden enthält. In der vorliegenden Arbeit wurde das aktive Zentrum der [FeFe]-Hydrogenase von Clamydomonas reinhardtii mit einer Kombination von EPR- und FTIR-spektroskopischen sowie elektrochemischen Methoden untersucht. Folgende Fragestellungen wurden dabei untersucht: • Der „super-reduzierte“ Zustand des H-Clusters (Hsred), der scheinbar nur in Algenenzymen als stabiler Verweilzustand existiert, wurde mittels EPR-Spektroskopie in Kombination mit FTIR-Spektroskopie untersucht. Die durchgeführte Analyse identifiziert Hsred als [4Fe-4S]1+FeIFeI Zustand, welcher gegenüber dem aktiven oxidierten Zustand Hox um zwei Redoxstufen reduziert ist. Proteinfilmelektrochemie (PFE) Experimente deuten auf die Beteiligung des „super-reduzierten“ Zustandes im katalytischen Zyklus hin. Ein neuer katalytischer Zyklus wurde basierend auf diesen Ergebnissen vorgeschlagen, in dem die Reduktion des Substrats zum terminalen Hydrid in einem Schritt vollzogen wird. • Die Biosynthese des H-Clusters wurde mittels EPR- und FTIR-Spektroskopie untersucht und die Analyse durch DFT-Rechnungen unterstützt. Es wurde gezeigt, dass drei freie Modellkomplexe der [2Fe]H-Untereinheit an den [4Fe-4S]-Cluster von HydF, einer für die Biosynthese des H-Clusters relevanten Maturase, binden und anschließend an die apo-[FeFe]-Hydrogenase transferiert werden können. Die apo-[FeFe]-Hydrogenase konnte in vollem Umfang nur mit einem Modellkomplex aktiviert werden, der eine Amin-Gruppe in der Dithiolat-Brücke enthält. Dieses Ergebnis bestätigt die Rolle der Amin-Base im katalytischen Mechanismus. • Anschließende biochemische Experimente in Kombination mit EPR- und FTIR-Spektroskopie zeigten, dass die apo-[FeFe]-Hydrogenase auch auf direktem Wege ohne die Beteiligung der HydF-Maturase mit einem Modellkomplex aktiviert werden konnte. Der so erhaltene H-Cluster ist von dem nativen System spektroskopisch nicht unterscheidbar. • FTIR Spektroelektrochemie wurde eingesetzt, um das Redoxverhalten von CrHydA1 mit dem aktiven semi-synthetischen H-Cluster und den inaktiven Derivaten in Gegenwart und in Abwesenheit von zugeführtem CO zu untersuchen. Zwei neue Redoxzustände wurden identifiziert, in denen der [4Fe-4S]-Cluster reduziert vorliegt. Dieses Ergebnis unterstützt die These, dass der [4Fe-4S]-Cluster an den Redoxübergängen im katalytischen Zyklus des Enzyms aktiv beteiligt ist. • Multi-Frequenz HYSCORE und ENDOR Untersuchungen wurden am Hybridenzym durchgeführt, welches mit einem nicht-natürlichen H-Cluster maturiert wurde. Dieses enthält statt einer Amin-Funktion in der Dithiolat-Brücke eine CH2-Gruppe. Die CN- Liganden dieses Hybrid-Clusters wurden mit 13C- und 15N-Isotopen markiert. Diese Studien erlaubten einen detaillierten Einblick in die Verteilung der Spindichte über beide CN- Liganden. Die Analyse der relativen Orientierung der 13C und 15N Hyperfeintensoren erlaubte die Annahme, dass das g-Achsensystem des H-Clusters im Hox Zustand die lokale Symmetrie der [2Fe]H-Untereinheit einnimmt. [FeFe] Hydrogenases are metalloenzymes which catalyze the oxidation of H2 as well as the reduction of protons to form H2. Understanding their catalytic mechanism and biosynthesis pathway as well as their electronic and geometrical structure is of great interest for biotechnology where they serve as models for the development of hydrogen conversion catalysts in renewable energy systems. The algal [FeFe] hydrogenase from Clamydomonas reinhardtii (CrHydA1) is a particularly convenient system for studying hydrogenase function since it contains only the active site and no additional iron-sulfur clusters which occur as electron transport pathway components in bacterial hydrogenases. The active site is referred to as the “H-cluster” and consists of a “classical” [4Fe-4S] cluster connected via a protein cysteine side group to a unique [2Fe]H sub-cluster containing CO and CN- ligands as well as bridging dithiolate ligand. In this thesis, combined EPR, FTIR and electrochemical methods were used to study the active site of the [FeFe] hydrogenase from Clamydomonas reinhardtii. The following topics were addressed: • The super reduced state of the H-cluster (Hsred) which only seems to be stable as resting state in CrHydA1 was characterized by EPR spectroscopy in combination with FTIR. These studies identified Hsred as a [4Fe-4S]1+FeIFeI configuration which is two steps reduced relative to the active oxidized state Hox. Protein Film Electrochemistry (PFE) experiments indicated involvement of the super reduced state in the catalytic cycle. We proposed a new catalytic cycle in which the reduction of a substrate proton to a terminal hydride occurs in one step. • The biosynthesis of the H-cluster was studied by FTIR and EPR methods supplemented by DFT calculations. It was shown that three mimic complexes of the [2Fe]H sub-cluster can bind to the [4Fe-4S] cluster of HydF (one of the maturases involved in the biosynthesis of the H-cluster) and then can be transferred to apo [FeFe] hydrogenase. The apo [FeFe] hydrogenase could be fully activated only with the mimic complex containing a bridging amine function in the dithiolate ligand confirming its postulated role in the catalytic mechanism. • Subsequent biochemical experiments combined with EPR and FTIR showed that the apo [FeFe] hydrogenase can be activated also directly by the mimic complex, i.e. without assistance of HydF, and that the H-cluster obtained in this way is spectroscopically undistinguishable from the native one. • FTIR spectroelectrochemistry was used to study the redox behavior of CrHydA1 in the presence and absence of extrinsic CO for the active semisynthetic H-cluster as well as for one of the non-active variants. Two new redox states were identified in which the [4Fe-4S]H sub-cluster was in the reduced state. This finding strongly supports a model in which the [4Fe-4S]H sub-cluster is actively participating in the redox transitions occurring during the catalytic cycle of the enzyme. • Multi-frequency HYSCORE and ENDOR studies were performed on a hybrid enzyme maturated with a non-natural H-cluster in which the bridging amine function was replaced by an inert CH2 group. The CN- ligands of this hybrid H-cluster were labeled with 13C and 15N. These studies provided detailed information on how the spin density is distributed over both CN- ligands. The detailed data on the relative orientation of the 13C and 15N magnetic interaction tensors allowed us to propose that the g-axis frame of the H-cluster in the Hox state adopts the local symmetry of the [2Fe]H sub-cluster.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	08.06.2015
Dateien geändert am:	08.06.2015
Promotionsantrag am:	23.11.2014
Datum der Promotion:	15.04.2015