Dokument: Charaktierisierung von SIVmac239 kodierten microRNAs

Titel:	Charaktierisierung von SIVmac239 kodierten microRNAs
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34474
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150603-093746-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ibing, Wiebke [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,44 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.06.2015 / geändert 03.06.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Hubert Schelzig [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	SIV, microRNA, virale miRNA, SIVmac239
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	2013 sind ca. 1,5 Millionen Menschen weltweit an den Folgen von AIDS gestorben. 2,1 Millionen Menschen infizierten sich neu mit HIV. Somit ist AIDS und HIV eine der der gefährlichsten Krankheiten unserer Zeit (UNAIDS/WHO, 2013). Um neue Therapien gegen AIDS und HIV zu entwickeln wurden verschiedenste Ansätze, wie der RNAi-Mechnismus, untersucht. RNAi ist ein Genregulations-Mechanismus, dessen Aufgabe die Regulation von zellulärer Genexpression ist (beschrieben in He et al., 2004). Mediatoren der iRNA sind meist microRNAs (Hutvanger et al., 2002). MicroRNAs (miRNAs) sind kleine einzelsträngige RNAs, die durch Inhibition der Translation oder Degradation von Ziel-mRNAs ein wichtiges Hilfsmittel bei der posttranskriptionellen Regulation von Zellfunktionen (Liu et al., 2011) sind. Die Regulation von verschiedenen miRNAs konnte bereits in HIV-1 infizierten Zellen nachgewiesen werden (Sun et al. 2011). Neben zellulären miRNAs haben auch virale miRNAs einen Einfluss auf die Translation von zellulärer und viraler mRNA. SIV als naher Verwandter des HI-Virus eignet sich besonders gut, um viral kodierte miRNAs in vitro und in vivo auch im Verlauf einer Infektion zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden die Identifizierung einer SIVmac239 kodierten miRNA sowie deren Charakterisierung und in vivo-Analysen durchgeführt. Für die in vitro Untersuchungen wurden C8166 und CEMx174 Zellen mit SIVmac239 infiziert (MOI 0,01). Der Infektionsverlauf wurde mittels des TZM-bl Tests und Immuno-Peroxidase Anti-Peroxidase Assays (IPAP) nachgewiesen. Die Virusreplikation wurde durch SIV-gag-spezifischen Primer mit Hilfe der qRT-PCR detektiert. Anschließend wurden sowohl aus den infizierten Zellen, als auch den Zellkulturüberständen kleine RNAs, wie miRNAs isoliert. Es zeigte sich, dass SIVmac239 eine RNA mit 22bp Länge synthetisiert. Diese konnte unter Verwendung zweier spezifischer miRNA-Assays detektiert werden. Das 3´-Ende der kleinen RNA konnte an der Base 802 des SIVmac239-Genoms bestimmt werden. Die detektierte miRNA liegt somit in der TAR-Region des SIVmac239-Genoms und wurde SIV-miR-TAR-5p benannt. Die Expression im Verlauf einer Infektion zeigte einen stetigen Anstieg der RNA bis Tag 8 nach der Infektion und einem anschließenden Abfall. Eine Überexpression in transgenen Zelllinien zeigte keinen Einfluss der SIV-miR-TAR in der Virusreplikation oder in der Apoptose der Zellen. Eine anti-apoptotische Wirkung konnte in HIV-miR-TAR transduzierten Zellen ebenfalls nicht nachgewiesen und bestätigt werden. Infektionen der transgenen Zelllinien mit Deletions-Mutanten VLPs zeigten keine Komplementierung der SIV-miR-TAR-5p und ebenfalls keinen Einfluss der SIV-miR-TAR-5p in der SI-Virusreplikation. Eine Isolation von Virionen aus dem Zellkulturüberstand ergab, dass die SIV-miR-TAR-5p in Mikrovesikeln (Virion und/oder Exosomen etc.) eingeschlossen wird. Eine erste in vivo-Pilotstudie mit 3 infizierten und 4 uninfizierten Rhesusaffen zeigte eine signifikante Erhöhung der Expression der SIV-miR-TAR in infizierten CD4+-Zellen. Im Weiteren sollte die genaue Funktion und in vivo Lokalisation ergründet werden, um einem weiteren Einblick und die mögliche therapeutische Relevanz der SIV-miR-TAR-5p abschätzen zu können. Micro RNAs (miRNAs) are small (approx. 20 nucleotides) non coding RNAs that can regulate gene expression posttranscriptionally by binding to mRNA. In humans, different roles for miRNA have been identified at the level of cell cycle, proliferation, differention, innate immune signalling and antiviral mechanisms. miRNAs can influence pathogenesis of viral infections including influenza, herpes viruses and HIV. HIV for example modulates levels of several miRNAs at various time points after infection but is itself also regulated by host miRNAs. The simian immunodeficiency virus (SIV) is excellent for the study of viral infections and host responses to infection. In order to assess the potential role of miRNAs in regulating infection of the simian immunodeficiency virus (SIV), in this thesis I used two different Human T cell leukemia cell lines named C8166 and CEMx174. Viral infection and viral titer measurement was analysed using the TZM-bl-assay and immuno-peroxidase anti-peroxidase-assay. Virus replication was detected via qRT-PCR using SIV-gag-specific primers. Small RNAs were isolated from cell culture supernatant and cells infected with SIV. Using two specific miRNA-qRT-PCR assays we could show, that SIVmac239 synthesizes a small, 22bp long RNA. This miRNA is located at the TAR region of SIVmac239 and 3´-ends at base 802. We named it SIV-miR-TAR-5p. During infection the SIV-miR-TAR-5p was significantly increased until day 8 post infection, thereafter the expression of SIV-miR-TAR-5p decreased again. Interestingly, overexpression of SIV-mir-TAR-5p in transgenic cells revealed no influence at virus replication or apoptosis. Although Klase et al. could show an anti-apoptotic effect of the HIV-miR-TAR, we did not detect any anti-apoptotic properties in HIV1-mir-TAR transduced cells. Using different SIVmac239-ΔR variants were not able to detect a complementation or an influence on the infection. Furthermore we could isolate virions of the cell culture supernatant and could show for the first time that SIV-miR-TAR-5p is included in mircovesicles, like virions or exosomes. A first in vivo-pilot study, using 3 infected and 4 non infected rhesus monkeys, showed a significant increase of SIV-miR-TAR-5p expression in infected monkeys.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	03.06.2015
Dateien geändert am:	03.06.2015
Promotionsantrag am:	24.03.2015
Datum der Promotion:	19.05.2015