Dokument: Combined Quantum Mechanical / Molecular Mechanical Investigation of
Enantioselective Reactions in Lipases

Titel:	Combined Quantum Mechanical / Molecular Mechanical Investigation of Enantioselective Reactions in Lipases
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3446
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20060706-001446-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Otte, Alexander-Nikolaj [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Thiel, Walter [Gutachter] Prof. Dr. Marian, Christel M. [Gutachter]
Stichwörter:	QM/MM, Computerchemie, Esterhydrolyse, Kinetik, Molekulardynamik, Freie Energie, Enantioselektivität, Enzym, kinetische Racematspaltung, LipaseQM/MM, computational chemistry, ester hydrolysis, free energy, molecular dynamics, enantioselectivity, enzyme, kinetic resolution, molecular modeling, serine hydrolase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der theoretischen Untersuchung der enantioselektiven Esterhydrolyse, welche durch das Enzym Lipase A von Bacillus subtilis katalysiert wird. Ein Modell aus Enzym, Substrat und Solvens wird atomistisch mit einer Kombination von quantenmechanischen (QM) und molekülmechanischen (MM) Methoden beschrieben. Dabei werden für den QM Teil Dichtefunktionalmethoden und für den MM Teil das Charmm22-Kraftfeld verwendet. Gemäss enzymkinetischen Untersuchungen an Lipasen und Serinhydrolasen erfolgt die Enantiodiskriminierung während der Acylierungsreaktion. Es ist allgemein akzeptiert, dass diese Reaktion über ein kurzlebiges tetraedrisches Intermediat verläuft, dessen Existenz allerdings experimentell für Lipasen noch nicht eindeutig nachgewiesen worden ist. Ein Teil dieser Arbeit befasst sich daher mit der theoretischen Charakterisierung dieses Intermediats. Hierzu werden Charmm22-Kraftfeldparamete für solche Intermediate durch Kalibrierung an ab initio Daten hergeleitet. Die Enantioselektivität der Lipase-katalysierten Esterspaltung wird exemplarisch für das chirale Substrat 1-(2-Naphthyl)-ethyl-acetat untersucht. Verschiedene mögliche Bindungsmoden des Substrats im aktiven Zentrum werden zunächst durch MM-basierte Molekulardynamik(MD)-Simulationen identifiziert. Vom tetraedrischen Intermediat ausgehend werden dann die beiden kovalenten Teilschritte der Acylierungsreaktion (vom Michaelis-Komplex über das Intermediat zum Acylenzym) auf QM/MM- Niveau mit zwei verschiedenen Ansätzen behandelt. Zum einen werden Reaktionspfade und stationäre Punkte auf QM/MM-Potentialflächen durch Geometrieoptimierungen bestimmt, aus denen man die Aktivierungsenergien für die Acylierungsreaktion erhält. Zum anderen werden die entsprechenden freien Aktivierungsenthalpien aus MD-Simulationen durch Umbrella Sampling ermittelt. Die quantitative Auswertung der Enantioselektivität wird mit einem stochastischen kinetischen Modell durchgeführt, welches die Simulation der kinetischen Racematspaltung ermöglicht und die Konkurrenz zwischen den Enantiomeren richtig erfasst. Die auf QM/MM Niveau berechneten Barrieren und Geschwindigkeitskonstanten dienen als Eingabeparameter für das kinetische Modell. Die erhaltenen Ergebnisse spiegeln die Komplexität der untersuchten enzymatischen Reaktion wider. Es zeigt sich, dass das Substrat in verschiedenen Orientierungen binden kann und dass die Potentialkurven für die Acylierungsreaktionen je nach Bindungsmodus und gewählter Startgeometrie für die Optimierungen unterschiedlich sein können. Das tetraedrische Intermediat ist meist ein sehr flaches Minimum, in manchen Reaktionspfaden fehlt es jedoch, so dass technisch saubere Ergebnisse nur über ausgedehnte MD-Simulationen mit Umbrella Sampling zu erzielen sind. Auf diese Weise wird die experimentell gefundene R-Enantioselektivität für das untersuchte Substrat korrekt wiedergegeben, allerdings bleibt der berechnete E-Wert zu klein. Die QM/MM-Untersuchungen liefern somit detaillierte qualitative Einsichten in den Mechanismus, aber noch keine quantitativ zuverlässigen Vorhersagen der Enantioselektivität. The present work is concerned with the theoretical investigation of enantioselective ester hydrolysis as catalysed by the enzyme lipase A of Bacillus subtilis. A model consisting of enzyme, substrate, and solvent is described at the atomistic level with a combined quantum-mechanical (QM) and molecular-mechanical (MM) approach. Density-functional theory (DFT) is used for the QM part and the Charmm22 force field for the MM part of the model. According to kinetic investigations of lipases and serine hydrolases, the discrimination of enantiomers occurs during the acylation steps of the reaction. It is commonly accepted that this step proceeds via an instable tetrahedral intermediate, whose existence has not yet been proven experimentally for lipases. One part of this work is therefore concerned with the theoretical characterisation of this intermediate. To this end, Charmm22 force field parameters were derived on the basis of ab initio data. The enantioselectivity of the lipase-catalysed ester hydrolysis was analysed exemplarily for the chiral substrate 1-(2-naphthyl)-ethyl-acetate. Different binding modes of the substrate in the active site were identified initially using MM-based molecular dynamics (MD) simulations. Starting from the tetrahedral intermediate, both covalent steps of the acylation reaction (from the Michaelis complex via the intermediate to the acylenzyme) were treated at the QM/MM level using two different methodological approaches. On the one hand, reaction paths and stationary points on the QM/MM potential energy surfaces were determined by geometry optimisation, from which activation energies of the acylation reaction were derived. On the other hand, the free energies of activation were computed using the umbrella sampling method. The quantitative analysis of enantioselectivity was performed with a stochastic kinetic model of the kinetic resolution experiment, which accounts for the competition between the enantiomers. The barriers and rate constants computed at the QM/MM level served as input parameters for the kinetic model. The results mirror the complexity of the enzymatic reaction. It is found that the substrate can bind in different orientations and that the potential-energy curves for the acylation reaction are strongly dependent on the binding modes and the starting geometries. The tetrahedral intermediate is often a shallow minimum, and is even nonexisting in some reaction paths, so that technically sound results can only be obtained using umbrella sampling simulations. In this manner the experimentally determined enantiopreference for the R-enantiomer is reproduced, however, with a too low E value. The QM/MM investigations are therefore able to provide qualitative insights into the mechanism, but not quantitative predictions of enantioselectivity.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie
Dokument erstellt am:	06.07.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	03.07.2006
Datum der Promotion:	03.07.2006