Dokument: Charakterisierung neuartiger K(ATP)-Kanalöffner vom Benzothiadiazin-, Benzofuran-, Benzothiophen- und Benzothiazol-Typ an HEK 293-(SUR2B/Kir6.1)- und CHO-(SUR1/Kir6.2)-Zellen - Funktioneller Nachweis einer dritten Bindungsstelle für Benzothiadiazin-Derivate am (SUR2B/Kir6.1)-K(ATP)-Kanal
| Titel: | Charakterisierung neuartiger K(ATP)-Kanalöffner vom Benzothiadiazin-, Benzofuran-, Benzothiophen- und Benzothiazol-Typ an HEK 293-(SUR2B/Kir6.1)- und CHO-(SUR1/Kir6.2)-Zellen - Funktioneller Nachweis einer dritten Bindungsstelle für Benzothiadiazin-Derivate am (SUR2B/Kir6.1)-K(ATP)-Kanal | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34451 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20150602-120743-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Schmidt, Claas [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Lemoine, Horst [Gutachter] Prof. Dr. Klöcker [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | ATP-sensitiver Kaliumkanal, KATP, Kaliumkanalöffner, Diazoxid, Allosterie, P1075 | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibung: | ATP-sensitive Kaliumkanäle (KATP-Kanäle) koppeln die Erregbarkeit – insbesondere durch das cytosolische Nukleotid-Verhältnis [ATP]/[ADP] – an den metabolischen Zustand der Zelle. Als integrale Membranproteine mit tetradimerem Aufbau (SURx/Kir6.y)x4 bestehen sie aus jeweils vier porenbildenden, einwärtsgleichrichtenden K+-Kanal-Untereinheiten (Kir6.y) sowie vier diese regulierende Sulfonylharnstoffrezeptor-Untereinheiten (SURx). Die Komposition aus verschiedenen Untereinheiten definiert eine gewisse Organselektivität: so exprimiert die ß-Zelle des Pankreas v. a. den (SUR1/Kir6.2)-K(ATP)-Kanaltyp, die Herzmuskelzelle den (SUR2A/Kir6.2)-Typ und die glatten Muskelzellen der Gefäße den (SUR2B/Kir6.1)-Typ. K(ATP) -Kanäle spielen physiologisch u. a. eine entscheidene Rolle in der Regulation der Glukosehomöostase (Insulinsekretion der Betazelle), des Muskeltonus der glatten Gefäßmuskulatur sowie bei zytoprotektiven Effekten (z. B. der ischämischen Präkonditionierung des Herzmuskels). Die SUR-Untereinheiten sind besonders interessant, weil sie eine pharmakologische Regulation der Kanalaktivität ermöglichen.
Eine Fülle verschiedener Wirkstoff-Klassen (z.B. Benzopyrane, Cyanoguanidine, Thioformamide, u. a.) interagiert mit den SUR2-Typ K(ATP) -Kanälen; darunter auch die Thieno-Thiadiazine-Dioxide, die interessante Charakteristika – wie den Übergang vom Agonisten zum Antagonisten nur durch das Fehlen einer einzigen Methylgruppe mit submicromolarer Wirksamkeit – aufweisen. Wir stellten nun die Frage, ob auch Benzo-Thiadiazin-Dioxide (i.e. Derivate der niederaffinen Muttersubstanz Diazoxid) geeignete, SUR2-selektive K(ATP)-Kanal-Öffner mit micromolarer Affinität darstellen, mit denen sich ein Agonist/Antagonist-Switch oder mit denen sich allosterische Wechselwirkungen mit anderen Substanzklassen am SUR2B-Rezeptor nachweisen lassen. I) In Zusammenarbeit mit der lokalen Organischen Chemie (Prof. Dr. M. Braun) wurden optimierte Diazoxid-Derivate dargestellt, die in 3'-Position mit aliphatischen und aromatischen Ringen unterschiedlicher Größe substituiert und in verschiedenen Testsystemen unseres Labors untersucht wurden. Neben der klassischen Radioligandbindung mit dem Cyanoguanidin [3H]-P1075 wurden neuere Verfahren eingesetzt, die die vollkinetische Messung der Membranpotentialveränderung durch die Diazoxid-Derivate mittels Fluoreszenz (Marker: DiBAC4(3) und DyeB) in eigenentwickelten 12-kanaligen Fluoreszenzdetektoren und damit u. a. die Unterscheidung von Agonisten und Antagonisten ermöglicht. Beide Testmethoden wurden an zellulären Testmodellen eingesetzt (HEK 293-(SUR2B/Kir6.1)- und CHO-(SUR1/Kir6.2)-Zellen), die es u. a. ermöglichen, die Selektivität für SUR2B- und SUR1-K(ATP)-Kanäle zu bestimmen. Mit den schrittweise optimierten Testsubstanzen konnte die Wirksamkeit und Affinität der Muttersubstanz Diazoxid bis zu 20-fach gesteigert werden, wobei die höchsten Werte (pKD < 6.3, -log mol/l) mit 4-, 5- und 6-gliedrigen Ringen (mit und ohne Brücken-C-Atom (CH2 -Gruppe) erzielt wurden, welche auch hohe Selektivitäten (~100-fach) zugunsten der SUR2B-Kanäle aufwiesen. Mit diesen affinitätsgesteigerten Diazoxid-Derivaten konnte die bisher ungeklärte Frage, ob chemisch-verschiedene Agonist-Klassen kompetitiv oder allosterisch am SUR2 interagieren – d. h. ob eine einheitliche oder unterschiedliche Bindungsstellen existieren – experimentell untersucht werden. Zur Klärung der Frage wurden Radioligandbindungsexperimente mit [3H]-P1075 in Dissoziationstechnik durchgeführt, wobei die Dissoziation des voräquilibrierten Radioliganden mitverschiedenen Liganden induziert werden kann: Induziert man die Dissoziation von [3H]-P1075 mit nicht-markiertem P1075 oder mit hochaffininen Benzopyran-Liganden (KC399, Bimakalim), so benötigt die Dissoziation von [3H]-P1075 t(1/2) ~ 13 min (koff ~ 0.05 min^-1 ), was einer kompetitiven Interaktion von Benzopyranen und Cyanoguanidinen an einer einheitlichen Bindungsstelle entspricht. Wird die Dissoziation dagegen mit hohen Konzentrationen der Diazoxid-Derivate (> 30 KD) induziert, so beschleunigt sich die [3H]-P1075-Dissoziation dramatisch (t(1/2) ~ 3 min), was eine allosterische Interaktion bzw. die Existenz zweier verschiedener Bindungsstellen für Diazoxid-Derivate und [3H]-P1075 beweist. Für das quantitative Verständnis des Phänomens beschleunigter Dissoziationen wurde ein mathematisches Modell abgeleitet, welches auch die Bestimmung der allosterischen Potenz einer Substanz erlaubt. II) Parallel zur Optimierung der Diazoxid-Struktur wurden Arbeiten mit der lokalen Organischen Chemie (Prof. Dr. M. Braun) durchgeführt, die zum Ziel hatten, den hocherfolgreichen benzanelierten, heterozyklischen 6-Ringen (z.B. Benzopyrane mit subnanomolaren Affinitäten) 5-Ringe (i.e. Benzofuran-, Benzothiophen-, und Benzothiazol-Derivate ) an die Seite zu stellen mit dem Ziel, die Subtyp-Erkennung der Substanzen zu verbessern. Als Hauptsubstitution wurde die Thioamid-Gruppe ausgewählt, die bei Benzopyranen eine subnanomolare Affinität (KC399) ermöglicht hatte. Die schrittweise Optimierung (Synthese – Testung – Modifikation der Synthese, etc.) der Substanzen sowie deren Testung in Radioligandbindungs- und Membranpotential-Experimenten ergab, dass alle heterozyklischen 5-Ringe K(ATP)-Kanal-Liganden sind und in der Regel als K(ATP)-Kanal-Agonisten wirken. Allerdings muss zur Erzielung mikromolarer Affinitäten die Thioamidgruppe mit einer Methyl-Gruppe vom heterozyklischen 5-Ring gespaced und weiter variiert werden, wie mit Benzothiazol-Derivaten nachgewiesen wurde. Einschränkend muss konstatiert werden, dass es nicht gelang, in den Bereich nanomolarer Affinitäten vorzustoßen. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Lasermedizin | |||||||
| Dokument erstellt am: | 02.06.2015 | |||||||
| Dateien geändert am: | 02.06.2015 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 04.06.2012 | |||||||
| Datum der Promotion: | 11.11.2014 |
