Dokument: Interaction of the two-component systems HrrSA and ChrSA in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Interaction of the two-component systems HrrSA and ChrSA in Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Interaktion der Zweikomponenten-Systeme HrrSA und ChrSA in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34351
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150508-144304-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hentschel, Eva [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,90 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.05.2015 / geändert 08.05.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter] Prof.Dr. Joachim F. Ernst [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Two-component systems (TCS) are the prevalent mode for bacteria to sense and respond to changes in their natural habitat. An important protein-cofactor and alternative iron source, sensed by TCS, is haem. In the Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum the TCS HrrSA is crucial for the utilization of haem. Besides HrrSA, a homologous haem-dependent TCS termed ChrSA could be identified. For the analysis of transient gene expression of ChrSA targets, appropriate reporters had to be constructed first. Autofluorescent proteins are valuable tools for the in vivo monitoring of gene expression. However, due to the relatively long half live of most fluorescent proteins, visualization of transient changes remains difficult. SsrA-mediated peptide tagging was used for the construction of destabilized eYFP. The C. glutamicum SsrA tag variants (AAEKSQRDYAASV and -AAV) turned out to be suitable for monitoring dynamic gene expression in C. glutamicum. The respective eYFP variants displayed half-lives of ~22 min (ASV) and ~8 min (AAV). Reporter studies using native eYFP provided strong evidence that ChrSA is the main activator of the divergently located operon hrtBA, encoding for a putative haem ABC transporter, which is required to counteract toxic intracellular accumulation of haem. Furthermore, ChrA acts as a repressor of the homologous response regulator hrrA providing first evidence for a close interplay of the TCS HrrSA and ChrSA. The major focus of this work was to assess the close interplay of HrrSA and ChrSA in haem-dependent signal transduction and to uncover mechanisms enforcing specificity. ChrSA and HrrSA share a high sequence similarity and inherit distinct roles in the control of haem-homeostasis. Both TCS exhibit a high level of cross-talk, counteracted by the phosphatase activity of the sensor kinases HrrS and ChrS, which was shown to be specific for their cognate response regulators. Mutation of a conserved glutamine residue within the phosphatase motif (DxxxQ) of HrrS and ChrS led to a highly increased activation of target gene reporters, confirming the catalytical role of this glutamine residue for phosphatase activity. As the phosphatase motif of HrrS and ChrS is completely identical, further catalytical residues involved in phosphatase reaction were identified. Besides phosphatase activity, pathway specificity can further be enhanced by molecular recognition. Analysis of chimeric proteins of HrrS and ChrS delivered first evidence, that residues forming the interface during phosphatase reaction are located inside the dimerization and histidine phosphotransfer (DHp) domain. Taken together, the results emphasize the importance of phosphatase activity and molecular recognition as crucial mechanisms to ensure pathway specificity of these haem-dependent and highly related TCS HrrSA and ChrSA in C. glutamicum. Zweikomponenten Systeme (ZKS) ermöglichen es Bakterien veränderte Umweltbedingungen wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Häm, welches von ZKS detektiert wird, stellt einen wichtigen Protein-Cofaktor und alternative Eisenquelle dar. In dem Gram-positiven Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum ist das ZKS HrrSA für die Verwertung von Häm verantwortlich. Zudem konnte neben HrrSA ein weiteres homologes Häm-abhängiges ZKS, ChrSA, identifiziert werden. Zur Analyse der transienten Genexpression der ChrSA Zielgene wurden zunächst geeignete Reporter konstruiert. Autofluoreszenzproteine sind ein verlässliches Werkzeug um die Genexpression in vivo zu messen. Aufgrund der relativ langen Halbwertszeit von Fluoreszenzproteinen ist eine Visualisierung der transienten Genexpression schwierig. Mittels eines SsrA Peptid-Tags wurde destabilisiertes eYFP konstruiert. Die C. glutamicum SsrA Tag Varianten (AAEKSQRDYAASV und –AAV) erwiesen sich als geeignet für die Analyse der dynamischen Genexpression in C. glutamicum. Für die jeweiligen eYFP Varianten wurden Halbwertszeiten von ~22 min (ASV) und ~8 min (AAV) ermittelt. Reporterstudien mit nativem eYFP lieferten wichtige Hinweise darauf, dass ChrA der Hauptaktivator des divergent lokalisierten Operons hrtBA ist, welches für einen putativen Häm- ABC Transporter kodiert und zur Vermeidung von toxischen intrazellulären Häm-Konzentrationen dient. Darüber hinaus reprimiert ChrA den homologen Antwortregulator hrrA, welches einen ersten Anhaltspunkt des engen Zusammenspiels der ZKS HrrSA und ChrSA lieferte. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf der Analyse der Interaktion von HrrSA und ChrSA während der Häm-abhängigen Signaltransduktion und der Aufklärung spezifitäts-vermittelnder Mechanismen. ChrSA und HrrSA besitzen eine hohe Sequenzähnlichkeit und übernehmen distinkte Funktionen bei der Kontrolle der Häm-Homöostase. Beide ZKS zeigen ein hohes Level an Kreuz-Phosphorylierung, dem die Phosphatase-Aktivität der Sensorkinasen HrrS und ChrS entgegenwirkt. Diese ist sehr spezifisch für den eigenen Antwortregulator. Eine Mutation des konservierten Glutamin-Restes innerhalb des Phosphatase-Motives (DxxxQ) von HrrS und ChrS führte zu einer erhöhten Aktivierung des Zielgenreporters, was die katalytische Funktion dieses Glutamin-Restes für die Phosphatase-Aktivität bestätigt. Da das Phosphatase-Motiv von HrrS und ChrS identisch ist, wurden weitere katalytische Reste, die für die Phosphatase-Aktivität verantwortlich sind, identifiziert. Neben der Phosphatase-Aktivität wird die Spezifität des Signalweges durch molekulare Erkennung vermittelt. Analysen von HrrS- und ChrS-Chimären lieferten erste Hinweise darauf, dass Aminosäurereste, welche während der Phosphatase-Reaktion die Verbindung zwischen Kinase und Antwortregulator bilden, in der Dimerisierungs- und Histidin-Phosphotransfer (DHp) Domäne lokalisiert sind. Zusammengefasst unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung von Phosphatase-Aktivität und molekularer Erkennung für die Signaltransduktionsspezifität dieser Häm-abhängigen und nah verwandten ZKS HrrSA und ChrSA in C. glutamicum.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	08.05.2015
Dateien geändert am:	08.05.2015
Promotionsantrag am:	27.02.2015
Datum der Promotion:	29.04.2015