Dokument: Von gezielter Oligomerisierung zu katalytisch aktiven inclusion bodies – Eine alternative Strategie zur Stabilisierung und Immobilisierung von Biokatalysatoren
| Titel: | Von gezielter Oligomerisierung zu katalytisch aktiven inclusion bodies – Eine alternative Strategie zur Stabilisierung und Immobilisierung von Biokatalysatoren | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34230 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160503-101432-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Diener, Martin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Industrielle Verfahren stellen häufig hohe Ansprüche an die Stabilität von Biokatalysatoren. In vielen Fällen ist daher eine Stabilisierung von Enzymen notwendig, um den verschiedenen, oft extremen Prozessbedingungen gerecht zu werden und einen biokatalytischen Prozess effizient zu gestalten. Deshalb sollte in dieser Arbeit eine neue Strategie zur Stabilisierung von Enzymen durch Erhöhung der Oligomerisierung etabliert werden, da es Beispiele für oligomere Enzyme gibt, welche stabiler sind als homologe monomere Varianten. Zu diesem Zweck wurde das dimere Modellenzym Arabidopsis thaliana Hydroxynitril Lyase (AtHNL) mit einem tetrameren coiled coil, der Tetramerisierungs-Domäne des Zelloberflächenproteins Tetrabrachion (TDoT) aus Staphylothermus marinus, fusioniert. Das Fusionsprotein wurde in Escherichia coli produziert, bildete allerdings unter verschiedensten Kultivierungsbedingungen lediglich große Mengen an inclusion bodies (IB), während kein lösliches Protein nachgewiesen werden konnte. Dennoch konnte überraschenderweise in der unlöslichen Fraktion aufgeschlossener Zellen Aktivität gemessen werden. Diese durch Fusion mit dem TDoT-tag erhaltenen katalytisch aktiven IBs (KatIBs) wurden eingehender charakterisiert. Dabei konnte im Vergleich zur wildtypischen AtHNL festgestellt werden, dass der pH-Wert einen geringeren Einfluss auf die Aktivität der AtHNL-KatIBs hatte und diese im schwach sauren pH-Bereich deutlich stabiler waren. Des Weiteren konnten AtHNL-KatIBs aufgrund ihrer Unlöslichkeit in wässrigen Puffersystemen und organischen Lösungsmitteln als natürliche Immobilisate zur Synthese von enantiomerenreinen (R)-Cyanhydrinen eingesetzt und in mehreren aufeinanderfolgenden Reaktionen wiederverwendet werden. Darüber hinaus konnte das Konzept der Bildung von KatIBs durch Fusion mit dem TDoT-tag auf weitere Zielproteine übertragen werden. So konnte die Bildung fluoreszenter YFP-IBs (yellow fluorescent protein) mittels Mikroskopie in vivo verfolgt werden. Anhand der komplexeren 2 Succinyl-5-Enolpyruvyl-6-Hydroxy-3-Cyclohexen-1-Carboxylat-Synthase aus E. coli (EcMenD) konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Bindung von Kofaktoren (ThDP, Mg2+) und eine korrekte Ausprägung von Quartärstrukturen keine Limitierung der KatIBs darstellen. Außerdem konnten EcMenD-KatIBs erfolgreich für die Synthese verschiedener 5 Hydroxy-4-oxo-5-Arylpentanoate eingesetzt und mittels einfachster Methoden in acht aufeinanderfolgenden Reaktionen ohne Aktivitätsverlust wiederverwendet werden. Ohne Optimierung der Expressionsbedingungen konnten KatIBs im Gramm-Maßstab aus einer 500 ml Expressionskultur gewonnen werden. Die entsprechenden Präparationen ähneln bezogen auf ihre Reinheit (> 85 %) einer mittels chromatographischen Methoden gereinigten Enzym-präparation. Aufgrund dieser Eigenschaften sind KatIBs somit eine hervorragende Alternative zu konventionellen Enzymimmobilisaten, was in Zukunft eine breite Anwendung in der Biokatalyse ermöglichen könnte.Industrial processes often require harsh reaction conditions and thus are challenging for the stability of the employed biocatalyst. In many cases, a stabilization of the enzyme is necessary to facilitate resistance to often extreme process conditions, thus rendering the respective biocatalytic process efficient. Therefore, the aim of this thesis was the development and evaluation of a new strategy to stabilize enzymes by induction of a higher oligomerization state, since there are examples of oligomeric enzymes that are more stable than monomeric homologous variants. To this end, a dimeric model enzyme, the Arabidopsis thaliana hydroxynitrile lyase (AtHNL) was fused to a tetrameric coiled coil, namely the tetramerization-domain of the cell surface protein Tetrabrachion (TDoT) from Staphylothermus marinus. The fusion protein was produced in Escherichia coli, however, under a variety of culturing conditions formed only large amounts of inclusion bodies (IB), while no soluble protein could be identified. Surprisingly, after cell disruption activity was detected in the insoluble cell fraction. Hence, the respective catalytically active IBs (CatIBs), obtained by fusion with the TDoT-tag, were further characterized. Thereby, activity and stability measurements revealed that AtHNL-CatIBs are active at lower pH values and are significantly more stable in the weakly acidic pH range than the wild-type AtHNL. Due to their insolubility in aqueous buffered media and organic solvents AtHNL-CatIBs can be regarded as natural enzyme immobilizates, which enabled their application for the synthesis of enantiomerically pure (R)-cyanohydrins and the recycling of the biocatalyst in several consecutive reactions. Furthermore, the general concept of the CatIB formation through fusion with the TDoT-tag could be transferred to additional target proteins. In this way, the formation of fluorescent YFP-IBs (yellow fluorescent protein) could be followed in vivo by fluorescence microscopy. By the use of the more complex 2-succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3 cyclohexene-1-carboxylate synthase from E. coli (EcMenD) it was possible to determine that even binding of cofactors (ThDP, Mg2+) and the need for correct assembly of quaternary structures pose no limitation for the formation of CatIBs. Additionally, EcMenD-CatIBs were successfully used to catalyze the synthesis of various 5-hydroxy-4-oxo-5-aryl pentanoates and enabled the simple recycling of the biocatalyst in eight consecutive reactions without loss of activity. In addition, CatIBs could be obtained on a gram scale without optimization of expression conditions from a 500 ml culture. The corresponding preparations were of similar purity as an enzyme preparation purified by chromatographic methods (> 85 %). Because of these properties CatIBs represent an excellent alternative to conventional enzyme immobilizates, which could facilitate a broad application in future biocatalysis. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.05.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.05.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 25.09.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.11.2014 |
