Dokument: Eine einfache Strategie zur Reinigung und Immobilisierung von Biokatalysatoren
| Titel: | Eine einfache Strategie zur Reinigung und Immobilisierung von Biokatalysatoren | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34229 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20150423-092645-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Kopka, Benita [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Immobilisierung von Enzymen ist besonders für den industriellen Einsatz von großer Bedeutung, um biokatalytische Prozesse ökonomisch und effizient ermöglichen zu können. Jedoch stellen aufwendige Enzymreinigungs- und Immobilisierungsverfahren einen großen Kosten- und Arbeitsaufwand dar, sodass eine möglichst einfache Reinigungs- und Immobilisierungsstrategie für Enzyme wünschenswert wäre, die mit wenigen Schritten und ohne teure Trägermaterialien realisierbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hierzu die Eignung von alternativen Immobilisierungstags evaluiert. Dazu wurde das Cellulose-Bindemodul der Exoglucanase/Xylanase Cex aus Cellulomonas fimi, eine Untergruppe der Kohlenhydrat-Bindemodule (carbohydrate-binding module, CBM), als Immobilisierungstag verwendet. Zum einfachen, nicht-invasiven Nachweis der Adsorption bzw. Immobilisierung an das Trägermaterial Cellulose wurde zunächst ein Fusionsprotein bestehend aus dem CBM und einem Flavin-basierten Fluoreszenzprotein (FbFP) erzeugt. Dieses Fusionsmodul wurde im Weiteren mit dem Modellenzym Hydroxynitril-Lyase aus Arabidopsis thaliana (AtHNL) fusioniert und die spezifische, affinitätsbasierte Immobilisierung an verschiedene Cellulosematerialien direkt aus Escherichia coli-Ganzzellextrakt in einem ausgezeichneten Reinheitsgrad nachgewiesen. Die Untersuchung der AtHNL-Aktivität und Stabilität des freien bzw. immobilisierten Fusionsproteins AtHNL-FbFP-CBM im schwach sauren pH-Bereich zeigte, dass es im Vergleich zur wildtypischen AtHNL über eine deutlich erhöhte pH-Stabilität verfügt, welche durch die Immobilisierung weiter verbessert werden konnte. Durch Fluoreszenzmessungen konnte des Weiteren die Stabilität der Adsorption an Cellulose im schwach sauren pH-Bereich gezeigt werden. Die Immobilisierung des Fusionsproteins AtHNL-FbFP-CBM auf verschiedenen Cellulosematerialien ermöglichte eine effiziente Produktion des enantiomerenreinen Cyanhydrins (R)-Mandelonitril in einem mikrowässrigen Reaktionssystem mit monophasischem Methyl-tert-Butylether als Reaktionsmedium. Dabei konnten die Cellulose-basierten Immobilisate mehrfach erfolgreich in der Synthesereaktion wiederverwendet werden. Die hier vorgestellte Immobilisierungsstrategie stellt somit eine hervorragende, alternative Möglichkeit dar, Enzyme auf einfache und kosteneffektive Weise zu immobilisieren.The immobilization of enzymes is of great importance for industrial applications, i.e. to facilitate economic and efficient biocatalytic processes. However, laborious enzyme purification and immobilization steps represent a major cost and time effort, so that a simple one-step enzyme immobilization strategy without the need for expensive carrier materials would be highly desirable. As part of this thesis the applicability of alternative immobilization tags was evaluated. For that purpose the cellulose-binding module of the exoglucanase/xylanase Cex from Cellulomonas fimi, a subfamily of the carbohydrate-binding modules (CBMs), was used as immobilization tag. To enable the easy, non-invasive detection of the adsorption or rather immobilization onto the carrier material cellulose, a fusion protein containing the CBM and a flavin-based fluorescent protein (FbFP) was constructed. This protein module was afterwards fused to the model enzyme hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana (AtHNL) and the specific, affinity-based immobilization to various cellulosic materials with an excellent purity directly from an Escherichia coli whole-cell extract was demonstrated. The investigation of AtHNL activity and stability of the free and immobilized fusion protein AtHNL-FbFP-CBM in the weakly acidic pH range revealed a significantly increased pH stability in comparison to the wild-type AtHNL. The stability was further improved by immobilization. Furthermore, the stability of adsorption to the cellulosic material in the weakly acidic pH range could be shown by fluorescence measurements. Immobilization of the fusion protein AtHNL-FbFP-CBM on various cellulosic materials enabled the efficient production of the enantiomerically pure cyanohydrin (R)-mandelonitrile in a micro-aqueous reaction system with monophasic methyl tert-butyl ether as the reaction medium. The cellulose-based immobilizates could be repeatedly and successfully reused in the synthesis reaction. In conclusion, the here presented immobilization strategy represents a promising alternative method to immobilize enzymes in a simple and cost-effective manner. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 23.04.2015 | |||||||
| Dateien geändert am: | 23.04.2015 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 25.09.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.11.2014 |
