Dokument: Autoimmune encephalitis: Analysis of the intrathecal plasma cell repertoire and expression of patient derived antineuronal antibodies in recombinant form

Titel:	Autoimmune encephalitis: Analysis of the intrathecal plasma cell repertoire and expression of patient derived antineuronal antibodies in recombinant form
Weiterer Titel:	Autoimmune encephalitis: Analysis of the intrathecal plasma cell repertoire and expression of patient derived antineuronal antibodies in recombinant form
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34219
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170508-091144-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Malviya, Manish [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,26 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.04.2015 / geändert 20.04.2015
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Als „Autoimmun-Enzephalitis“ (AIE) wird eine Gruppe von Syndromen genannt, die durch Autoantikörper gegen synaptische oder neuronale Zelloberflächen-Proteine gekennzeichnet sind. Frühere Studien, die mithilfe von Serum und Liquor (engl. cerebrospinal fluid, CSF) von AIE Patienten durchgeführt wurden, beschrieben antineuronale Autoantikörper, die spezifisch gegen den AMPA-Rezeptor, NMDA-Rezeptor, leucine-rich glioma inactivated protein 1 (LGI1), contactin-associated protein-like 2 (CASPR2) oder Glutamat Decarboxylase (GAD65) gerichtet sind. Um Ursprung und Funktion der intrathekalen Autoantikörper bei AIE Patienten näher zu charakterisieren, war es Ziel dieser Arbeit, das Immunrepertoire intrathekaler CD138+ Plasmazellen zu untersuchen und einige der antineuronalen Autoantikörper in Form von rekombinanten humanen monoklonalen Antikörpern (rhuMAb) nachzubilden. Zu diesem Zweck analysierten wir 584 einzelne, FACS sortierte Plasmazellen aus dem Liquor von fünf AIE Patienten mit Hilfe der Einzelzell-RT-PCR und konnten von 508 Zellen die Immunglobulin Schwerkettensequenz ermitteln. Durch Analyse der CDR3-Sequenzen wiesen wir in allen untersuchten Liquor-Zellproben klonal expandierte Plasmazellen (cePc) nach und identifizierten insgesamt 57 unabhängige Plasmazell-Klone. Zudem untersuchten wir die relative Häufigkeit der Immunglobulin-Gen-Familien: Ein Patient mit gesicherter anti-LGI1-Autoimmun-Enzephalitis (Patient GKD) zeigte eine klare Überrepräsentation der VH4 Familie. Die VH1 Familie war dahingegen bei einem Patienten mit anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis (Patient SSM) unterrepräsentiert. Zwei Patienten mit CASPR1 Autoantikörpern (Patienten KKM & BRM) hatten ähnliche Verteilungsmuster der VH-Genfamilien in folgender Reihenfolge der Häufigkeiten: VH3>VH1>VH4>VH5. Nur bei einem Patienten mit anti-CASPR2 Autoantikörpern konnten auch Amplikons der VH7 Familie zugeordnet werden. Die VH1 Sequenz-Familie war hauptsächlich in einem Patienten mit GAD65 (JMB) Autoantikörpern präsent. Um herauszufinden, ob cePc die tatsächlichen Produzenten der intrathekalen Autoantikörper Antwort sind, klonierten und exprimierten wir die zueinander gehörenden Immunglobulin Schwer- und Leichtkettengene von 16 expandierten Plasmazellklonen und von einer nichtexpandierten Plasmazelle von drei der fünf AIE Patienten und stellten dadurch exakte Kopien der intrathekalen Autoantikörper her. Jeweils sieben rhuMAb (SSM1-7 bzw. GKD1-7) wurden von einem Patienten mit anti-NMDA-Rezeptor bzw. anti-LGI1-Enzephalitis generiert. Drei weitere Antikörper (JMB1-3) wurden aus den cePc Klonen eines Patienten mit anti-GAD65 Enzephalitis hergestellt. Sechs der rekonstruierten 17 Antikörper (GKD3, GKD4, GKD5, SSM5, JMB2 und JMB3) zeigten eine klare Reaktivität gegen die vermuteten Ziel-Antigene in vitro. Unsere Untersuchungen zeigen, dass klonal expandierte intrathekale Plasmazellen zur Produktion von antineuronalen Autoantikörpern beitragen. Durch die Rekonstruktion von funktionalen, humanen, monoklonalen Autoantikörpern aus den CSF cePc in Form von rhuMAb wiesen wir zudem eine ZNS-spezifische humorale Immunantwort im Liquorkompartiment von AIE Patienten nach. Antineuronale Autoantikörper, die ausgehend vom Patientenmaterial in rekombinanter, monoklonaler Form rekonstituiert werden, stellen sehr gute Werkzeuge für die funktionelle Charakterisierung, Epitopentschlüsselung und detaillierte Untersuchung der Antikörper-Beteiligung an der AIE Pathogenese in vitro und in vivo dar. Einige dieser Antikörper könnten zudem von therapeutischem Nutzen sein bei neurologischen Erkrankungen, die z.B. von einer Blockade NMDA-Rezeptor mediierter Exzitotoxizität profitieren. The autoimmune encephalitis (AIE) syndromes are a recently identified group of conditions associated with autoantibodies specific for neuronal cell-surface or synaptic proteins. Previous studies of cerebrospinal fluid (CSF) and serum of patients with AIE have described the presence of antineuronal autoantibodies specific for the NMDA receptor, AMPA receptor, leucine-rich glioma inactivated protein 1 (LGI1), contactin-associated protein-like 2 (CASPR2), glutamic acid decarboxylase (GAD65) and others. To investigate the origin and function of intrathecal autoantibodies in AIE patients, we aimed to examine the CD138+ plasma cell repertoire and to reconstruct some of the antineuronal autoantibodies in the form of recombinant human monoclonal antibodies (rhuMAb). After FACS sorting, we analysed 584 individual CSF plasma cells from five AIE patients by single cell RT-PCR, yielding 508 immunoglobulin heavy chain sequences. By analysis of the CDR3-sequence we detected clonally expanded plasma cells (cePc) in every examined CSF sample and identified a total of 57 independent plasma cell clones. We also analysed the relative representation of immunoglobulin germline families: A patient prediagnosed with anti-LGI1 autoantibodies (GKD) had a clear overrepresentation of the VH4 family. The VH1 family was underrepresented in a patient with anti-NMDA receptor autoantibodies (SSM). Two patients with anti-CASPR2 autoantibodies (KKM & BRM) had similar patterns of germline gene family representation in order of VH3>VH1>VH4>VH5. One of the patients with anti-CASPR2 autoantibodies also represented VH7 family. The VH1 family was mostly represented in a patient prediagnosed with anti-GAD65 (JMB) autoantibodies. To elucidate whether cePc are the actual source of the intrathecal autantibody response, we successfully cloned and expressed paired immunoglobulin heavy and light chain genes from 16 cePc and one nonexpanded plasma cell from three of the five patients. Seven rhuMAb (SSM1-7) were reconstructed from a patient diagnosed with anti-NMDA receptor encephalitis; another seven antibodies (GKD1-7) were reproduced from a patient diagnosed with anti-LGI1 encephalitis; and three rhuMAb (JMB1-3) were made from a patient diagnosed with anti-GAD65 encephalitis. Six of the rhuMAb reconstructed from cePc, namely GKD3, GKD4, GKD5, SSM5, JMB2 and JMB3, showed a clear reactivity to their presumed cognate target antigens in vitro. Our findings provide evidence that clonally expanded intrathecal plasma cells/blasts contribute to the production of antineuronal autoantibodies in AIE patients. By reconstructing functional autoantibodies from CSF cePc in the form of rhuMAb, we demonstrate the presence of a CNS-specific antigen driven humoral immune response in the CSF compartment of AIE patients. Having patient derived antineuronal autoantibodies in recombinant monoclonal form may be an appropriate tool to analyse their precise epitope specificity and functional properties, which may help to understand the exact mechanisms of their role in disease pathogenesis. Some of the patient derived antineuronal rhuMAb could also be used to study their therapeutic usefulness in other neurological diseases, in which it may be beneficial e.g. to block NMDA receptor mediated excitotoxicity.
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Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » An-Institute » Neurologisches Therapiecentum (NTC) an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Dokument erstellt am:	08.05.2017
Dateien geändert am:	08.05.2017
Promotionsantrag am:	18.12.2014
Datum der Promotion:	24.03.2015