Dokument: Structural investigation of the interaction of the human BST2 with the HIV-1 Virus protein U

Titel:	Structural investigation of the interaction of the human BST2 with the HIV-1 Virus protein U
Weiterer Titel:	Strukturelle Untersuchung der Interaktion des humanen BST2 mit dem HIV-1 Virus-Protein-U
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34115
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150416-110805-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Roes, Claas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,58 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.04.2015 / geändert 09.04.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] PD. Dr. König, Bernd [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The protein BST2 is part of the intrinsic immune defense of the human cell. It is localized at the cell membrane. It restricts the budding of retroviruses from infected cells. The protein tethers the virus particles to the cell membrane, thus preventing infection of other cells. BST2 is an important component of the human immune response against enveloped viruses. The human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) can circumvent this mechanism by using its Virus protein U (VpU). VpU binds BST2 and down regulates it from the cell surface. The aim of this work is the structural characterization of the interaction between BST2 and VpU on a molecular level by using liquid-state NMR spectroscopy. VpU consists of an N-terminal transmembrane helix and a cytoplasmic domain. BST2 contains a short cytoplasmic region, a transmembrane helix, a helical extracellular domain and a C-terminal GPI-anchor. Full-length VpU and the N-terminal region of BST2 containing the cytoplasmic and the transmembrane domain (BST2tmcyt) were used in the interaction study. An E. coli-based system for cell-free protein synthesis was established in the course of this work. This technique allows very efficient production and purification of the two membrane proteins in the presence of mild detergents. Isotope labeled amino acid mixtures (U-15N, U-13C and/or U-2H) were employed in the protein synthesis as needed. Different labeling patterns were used. Both membrane proteins were incorporated into dodecylphosphocholine (DPC) micelles in order to keep them in solution during the NMR measurements. An almost complete backbone 13C, 15N and 1H resonance assignment of BST2tmcyt in DPC micelles was accomplished by using multi-dimensional NMR experiments. More than 70% of the backbone resonances were assigned for VpU. Secondary structure and backbone order parameters of both proteins in DPC micelles were derived from the experimental chemical shifts. Amino acids of both proteins involved with the interaction between VpU and BST2 were determined by titrating 15N-labeled protein with the non-labeled interaction partner. In contrast to previous studies, discrete interaction sites were found not only in the transmembrane helices but also in the cytoplasmic domains of both proteins. Das humane BST2 ist ein Protein der intrinsischen Immunabwehr der Zelle und in der Zellmembran lokalisiert. BST2 verhindert die Freisetzung von Retroviren aus bereits infizierten Zellen. Neu gebildete Viruspartikel verbleiben an der Zelloberfläche, können keine weiteren Zellen infizieren und werden schließlich abgebaut. BST2 ist ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunität des Menschen gegen behüllte Viren. Das Humane Immundefizienz-Virus Typ-1 (HIV-1) kann den BST2-basierten Schutzmechanismus umgehen. Verantwortlich dafür ist das HIV-1 Virus-Protein-U (VpU). VpU bindet BST2 und reguliert es von der Zelloberfläche herunter. Das Ziel dieser Arbeit war die strukturbiologische Charakterisierung der molekularen Wechselwirkung der Membranproteine BST2 und VpU mit Lösungs-NMR-Spektroskopie. VpU besteht aus einer N-terminalen Transmembranhelix und einer zytoplasmatischen Domäne. BST2 enthält einen kurzen zytoplasmatischen Bereich, eine Transmembranhelix, eine helikale extrazelluläre Region und einen C-terminalen GPI-Anker. Für die Interaktionsstudie wurde VpU voller Länge sowie der N-terminale Bereich des BST2 aus zytoplasmatischer und Transmembrandomäne (BST2tmcyt) rekombinant hergestellt. Dazu wurde im Zuge dieser Arbeit die E. coli-basierte zellfreie Proteinsynthese etabliert. Damit ließen sich die beiden Membranproteine sehr effizient in Anwesenheit milder Detergentien herstellen und reinigen. Die Synthese erfolgte bei Bedarf mit isotopenmarkierten (U-15N, U-13C bzw. U-2H) Aminosäuren. Es wurden unterschiedliche Markierungsmuster der Zielproteine realisiert. Für die NMR Untersuchungen wurden die beiden Membranproteine in membransimulierende Mizellen aus dem zwitterionischen Detergens Dodecylphosphocholin (DPC) eingebracht und so in Lösung gehalten. Mit Hilfe mehrdimensionaler NMR-Experimente erfolgte eine nahezu vollständige Zuordnung der 13C, 15N, und 1H-Resonanzen des Proteinrückgrats von BST2tmcyt. Im Falle des VpU konnten mehr als 70% der entsprechenden Rückgratatome zugeordnet werden. Auf Basis der experimentellen chemischen Verschiebungen wurde die Sekundärstruktur und Rückgrat- Ordnungsparameter beider Proteine in DPC-Mizellen ermittelt. Die an der VpU-BST2 Interaktion beteiligten Aminosäuren der beiden Proteine wurden in zwei Titrationen bestimmt, wobei jeweils ein 15N-markiertes Protein mit dem unmarkierten Interaktionspartner titriert wurde. Diskrete Bindungsstellen wurden im Gegensatz zu früheren Arbeiten nicht nur in den Transmembranhelices, sondern auch in den zytoplasmatischen Domänen beider Proteine lokalisiert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	16.04.2015
Dateien geändert am:	16.04.2015
Promotionsantrag am:	11.12.2014
Datum der Promotion:	20.01.2015