Dokument: Funktionelle Charakterisierung von unklassifizierten hMSH2 Varianten in Saccharomyces cerevisiae

Titel:	Funktionelle Charakterisierung von unklassifizierten hMSH2 Varianten in Saccharomyces cerevisiae
Weiterer Titel:	Functional characterization of unclassified hMSH2 variants in Saccharomyces cerevisiae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33933
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150401-104946-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Heick, Sven Boris [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.03.2015 / geändert 30.03.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die korrekte Replikation der Erbinformation ist essentiell, um genomische Stabilität zu gewährleisten. Der in vivo Prozess der DNA-Replikation geschieht dabei mit einer Genauigkeit von ca. 1x10^10. Diese hohe Genauigkeit wird durch die „Proofreading“-Funktion der DNA-Polymerase selbst sowie über den postreplikativen Mechanismus der DNA-Fehlpaarungsreparatur (Mismatch repair = MMR) erreicht. Falsch eingebaute Nukleotide im neusynthetisierten Tochterstrang resultieren in Basenfehlpaarungen (Mismatch), welche durch die „Proofreading“-Funktion teilweise nicht erkannt werden. In Humanzellen werden diese Fehler dann durch den hMutSα-Komplex erkannt, einem Heterodimer bestehend aus den Proteinen hMSH2 und hMSH6. Durch die Interaktion mit weiteren Proteinen resultiert dies im Abbau des fehlerhaften Stranges sowie dessen Neusynthese. Mutationen in Genen der humanen Fehlpaarungsreparatur, welche in einer reduzierten oder inaktiven Proteinfunktion resultieren, führen zum Lynch-Syndrom, einem vererbbarem Krebsleiden. Ca. 20% aller Mutationen in dem Fehlpaarungsreparaturgen hMSH2 sind „Missense“-Mutationen. Der Einfluss dieser Art von Mutation ist nicht vorhersagbar, so dass funktionelle Testsysteme angewendet werden müssen, um eine Aussage über die Funktionalität zu erhalten. Ziel dieser Arbeit war es, „Missense“-Mutationen von Patienten des deutschen HNPCC-Konsortiums auf Funktionalität zu charakterisieren. Für eine funktionelle Analyse von 10 hMSH2-„Missense“-Mutationen wurde der Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae genutzt. Da humanes MSH2 das Hefe-Msh2p nicht funktionell ersetzen kann, wurden dieser Arbeit 11 neuartige Hefe-Mensch-Msh2 Hybride entwickelt, die eine Analyse von Mutationen in der Fehlpaarungsreparatur in vivo ermöglichen sollten, da humane Testsysteme für solche Analysen bisher nicht verfügbar sind. Für die Konstruktion wurden Abschnitte des Hefe-Msh2p gegen entsprechende Abschnitte des humanen MSH2 ersetzt, um dort später Mutationen einzufügen und zu untersuchen. Von 11 Hybriden zeigten unter starker Überexpression 7 wildtypähnliche Funktionalität. Von diesen sieben und einem im Vorfeld konstruierten Hybrid konnten 3 erfolgreich genomisch in den yMSH2-Lokus integriert werden, um so eine Untersuchung unter endogenen Bedingungen vorzunehmen. Die wildtypähnliche Funktionalität konnte hier erneut bestätigt werden. In den humanen Abschnitt von 2 funktionellen Hefe-Mensch-Msh2-Hybriden wurden insgesamt 10 humane Mutationen einzeln integriert und auf Funktionalität geprüft. Drei Mutationen im N-Terminus zeigten nach Integration in ein N-terminales Hybrid wildtypische Aktivität. Von sieben untersuchten Mutationen im C-Terminus zeigten unter hohen Expressionsbedingungen 2 Mutationen wildtypische Aktivität, die restlichen 5 Mutationen waren nicht funktionell. Unter endogenen Bedingungen konnte für diese 2 wildtypischen Mutationen gezeigt werden, dass nur noch eine wildtypisch ist – die andere zeigte kompletten Funktionsverlust. Da die Koexpression von wildtypischen humanem MSH2 mit seinem Interaktionspartner hMSH6 in der Hefe einen dominant-negativen Mutatorphänotyp auslöst, wurden hMSH2-Allele mit hMSH6 koexprimiert. Von 10 untersuchten Mutationen zeigten 4 wildtypische Funktionalität. Zum Nachweis der Interaktion wurde eine Co-Immunopräzipitation von hMSH2 mit hMSH6 durchgeführt. Es zeigte sich, dass für zwei Mutationen wildtypähnliche Mengen an hMSH2 kopräzipitiert wurden. Für die anderen 8 Mutationen zeigte sich eine reduzierte Menge des kopräzipitieren hMSH2, was darauf schließen lässt, dass die Interaktion reduziert ist. Neben weiteren Expressionsanalysen konnte insgesamt gezeigt werden, dass von 10 untersuchten Mutationen nur 2 als wildtypisch eingestuft werden konnten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde in 2 experimentellen Ansätzen untersucht, welchen Einfluss das Altern auf die Fehlpaarungsreparatur von Hefezellen nimmt. Mittels replikativer Alterung wurde untersucht, wie sich die Fehlpaarungsreparatur in Zellen verändert, die viele Teilungen durchlaufen haben. Biotinylierte alte Zellen wurden magnetisch von jungen Zellen getrennt und anschließend auf Mutationen mit steigender Generationenanzahl untersucht. Es zeigte sich, dass die Mutationszahl eines Wildtypstammes nach 19 Generationen im Vergleich zu Generation 0 um den Faktor 3,4 erhöht war, was auf einen Zusammenhang zwischen Alterung und der Genauigkeit der DNA-Replikation / Fehlpaarungsreparatur schließen lässt. Interessanterweise zeigte auch ein Δmsh2 Stamm eine erhöhte Mutationszahl, wenn auch um den Faktor 2 niedriger als Wildtyp. Anschließend wurde in chronologisch alternenden Hefezellen geprüft, wie sich die Mutationsrate verändert, wenn die Zellteilung nach einer definierten chronologischen Alterung wieder einsetzt. Hier zeigte sich, dass Zellen, die sich nach 24 Tagen wieder zu teilen begannen, eine erhöhte Anzahl von Mutationen zeigten. Die Daten weisen darauf hin, dass das Alter einen Einfluss auf die Effizienz der Fehlpaarungsreparatur und/oder der DNA-Replikation nimmt. The correct replication of DNA is essential to maintain genomic stability. In vivo DNA is replicated with a fidelity of approx. 1x10^10. This high fidelity is achieved by the proofreading function of the polymerase itself and a postreplicative mechanism called mismatch repair (MMR). The newly synthesized daughter strand contains misincorporated nukleotides, which partially were not recognized by the proofreading function of the polymerase, resulting in mismatched base pairs. In human cells, mismatches are recognized by a protein heterodimer called hMutSα which consists of the proteins hMSH2 and hMSH6. The downstream interaction with other proteins results in the degradation of a stretch of nucleotides including the wrongly-incorporated one in the daughter strand followed by resynthesis. Mutations in the human mismatch repair genes can lead to decreased or inactive protein function resulting in the Lynch syndrome, a hereditary cancer disease. About 20% of all mutations in the gene hMSH2 are missense mutations. Unfortunately, the consequences of these mutations on the protein function are not predictable and therefore functional assays are needed to determine their impact on the MMR process. Unfortunately, functional in vivo MMR assays are not available in human cells. The first aim of this work was to functionally characterize hMSH2 missense mutations from patients of the German HNPCC consortium in vivo in the yeast model system. Because the human MSH2 protein cannot functionally replace the yeast Msh2p, new yeast-human-Msh2 hybrid proteins were created by exchanging yeast protein regions with the corresponding human regions. Seven of the 11 hybrid proteins created showed wildtype like MMR activity in vivo when expressed at high levels. Two of these and a previously created hybrid were successfully integrated into the chromosomal yMSH2 locus to analyze their function under endogenous conditions. Again, these hybrids showed wildtype-like activity. Subsequently, ten hMSH2 mutations from the German HNPCC consortium were introduced into functional Msh2 hybrids to analyze their in vivo MMR function. Three mutations in the N-terminus showed wildtype-like activity, while only 2 of 7 mutations in the C-terminus showed full MMR activity. Subsequent expression under endogenous conditions showed that only 1 of these 2 mutations of the C-terminus was functional. For further analysis the 10 mutations were introduced individually into the human MSH2 gene and co-expressed in yeast with its human interaction partner hMSH6. Expression of wildtype hMSH2 and hMSH6 causes a dominant negative mutator phenotype resulting in an increased mutation rate. Four of 10 mutations analyzed showed wildtype-like activity. Finally, to check their ability to interact with hMSH6, the 10 hMSH2 protein alleles were co-immunoprecipitated. Eight out of 10 mutant alleles showed reduced hMSH2 protein amounts suggesting that the interaction with hMSH6 is affected. In summary, only 2 of the 10 mutations were classified as wildtype-like according to this functional analysis. The second aim of this work was to analyze the influence of aging on DNA mismatch repair in two experimental settings in yeast. Replicative aging was used to analyze mismatch repair in replicatively aged cells. Wildtype cells were biotinylated and sorted magnetically to enrich old mother cells. Subsequently, the number of mutations was determined in cells of generation 0 compared to cells at generation 19. Interestingly, old cells showed 3.4-fold higher mutation numbers. Because a Δmsh2 strain only showed an increase of about 1.4-fold, this suggests that possibly both the fidelity of replication and of the MMR decrease during aging. In a second approach, the effect of chronological aging of non-dividing cells was analyzed. Again, cells which re-entered the cell cycle after 24 or more days of rest, showed an increased number of mutations compared to day 0. In summary, replicative as well as chronological aging shows an influence on the number of mutations suggesting that DNA mismatch repair could be affected.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	01.04.2015
Dateien geändert am:	01.04.2015
Promotionsantrag am:	14.01.0014
Datum der Promotion:	30.04.2014