Dokument: X-ray crystallographic study on the mechanisms of Bacteriorhodopsin and the Sensory Rhodopsin/Transducer Complex

Titel:	X-ray crystallographic study on the mechanisms of Bacteriorhodopsin and the Sensory Rhodopsin/Transducer Complex
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3393
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20060516-001393-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Moukhametzianov, Rouslan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 22,07 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Büldt, Georg [Gutachter] Dr. Labahn, Jorg [Gutachter]
Stichwörter:	Mikrobielle Rhodopsine, Photorezeptor, Transducer, Röntgenstruktur, kubischen Lipidphase, IntermediateMicrobial Rhodopsins, Photoreceptor, Transducer, X-ray atomic structure, cubic lipidic phase, intermediate
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Mikrobielle Rhodopsine gehören zur Familie der sieben-helikalen transmembranen Retinalproteine, die in Bakterien, Archaea und Eukaryoten gefunden werden. Man nimmt an, dass sie die Archetypen für Ionen- und Signaltransportproteine darstellen. Sie zeichnen sich durch ein gemeinsames strukturelles Design aus, um diese spezifischen Funktionen ausführen zu können. Die Ionenpumpen Bacteriorhodopsin (BR) und Halorhodopsin (HR) sind Energieumwandler, während die Photorezeptoren Sensory Rhodopsin I (SRI) und II (SRII) als Lichtrezeptoren wirken, die ein Signal generieren, das über Rezeptor-spezifische Transducer-Moleküle (HtrI und HtrII) eine Zweikomponenten-Signalkaskade aktiviert, so dass die Zelle sich in Abhängigkeit von den Lichtverhältnissen bewegt. Die archaebakteriellen Rhodopsine sind die am besten charakterisierten Proteine unter den sieben-helikalen Rezeptoren im Hinblick auf strukturelle Information aus Röntgenkristallographie-Daten. Es existieren bereits hoch-aufgelöste Strukturen von Sensory Rhodopsin II aus dem Natronobacterium pharaonis und von Bacteriorhodopsin und Halorhodopsin aus dem Halobacterium salinarum. Die Röntgenstruktur des Komplexes aus N. pharaonis SRII (pSRII) und pHtrII bei 1.94 Å wurde bereits beschrieben. In dieser Arbeit wurden mittels Röntgenkristallographie die Strukturen des Grundzustandes, des frühen K-Zustandes und des späten M-Signalzustandes mit dem zugehörigen Transducer untersucht, sowie die Strukturen des Grundzustandes und des späten M-Zustandes von Bacteriorhodopsin. Alle Kristalle sind in der kubischen Lipidphase gewachsen und erreichten im Falle des Sensory Rhodopsin/Transducer Komplexes eine Auflösung von 1.9 Å für den Grundzustand, 2.0 Å für den K-Zustand und 2.2 Å für den späten M-Zustand und im Falle von Bacteriorhodopsin 1.35 Å für den Grundzustand und 1.5 Å für den späten M-Zustand. Die Besetzungen der Intermediate, fixiert in den Kristallen durch Cryo-Temperaturen, wurden aus der kristallographischen Analyse abgeschätzt. Die Strukturlösungen, basierend auf der Methode des „Molekularen Ersatzes“, lieferten atomare Bilder des Grund-, K- und M-Zustandes des pSRII/Transducer Komplexes sowie des Grund- und M-Zustandes von Bakteriorhodpsin. Für das Refinement wurde die Methode des „simulated annealing“ für Modelle benutzt, die entsprechend den Besetzungen aus zwei Konformationen bestanden, eine für den Grundzustand und eine für das Intermediat. Zusätzlich wurde untersucht, ob experimentelle Phasen, die über die Methode des isomorphen Ersatzes oder aus anomaler Streuung gefunden wurden, bei der Ermittlung der Transducerstruktur einschließlich der Linkerdomäne helfen würden. Die Beugungsdaten wurden in unterschiedlichen kristallographischen Raumgruppen analysiert, um Strukturdaten der kompletten Faltung des Transducers zu gewinnen. Die Resultate liefern ein Verständnis der Signalübertragung vom pSRII zum Transducer für den Membranteil des Proteinkomplexes sowie im Falle von Bacteriorhodpsin wurden Details des Protonenleitungsweges erhalten. Die beobachteten strukturellen Änderungen erlauben mir, einen Mechanismus für die lichtinduzierte Aktivierung des Komplexes vorzuschlagen: Die durch Licht induzierte Retinalisomerisierung führt im K-Zustand zu einer Neuordnung eines Wasserclusters, wodurch einige Wasserstoffbrücken zwischen zwei Helices im pSRII aufgelöst werden. Diese Änderungen im Wasserstoffbrückennetzwerk schreiten fort im Übergang zum späten M-Zustand. Dieses neue Wasserstoffbrückennetzwerk und die Änderungen in der Ladungsverteilung führen zu Änderungen in der Tertiärstruktur, wodurch der Signalzustand erreicht wird. Zwei teilweise entkoppelten Domänen des Rezeptors verschieben sich zueinander. Dies ist sehr signifikant zwischen den Helices F und G, die eine Oberfläche zur Helix TM2 des Transducers haben. Der Transducer antwortet auf diese Rezeptoraktivierung durch eine Rotation der Helix TM2 um 15 Grad und einer Verschiebung dieser Helix um 0.9 Å an der cytoplasmatischen Oberfläche. Die späte M-Zustandsstruktur von Wildtyp-Bacteriorhodopsin erweitert die früher publizierten Kenntnisse dieses wichtigen Intermediates. Die erreichte Auflösung von 1.5 Å und die niedrige Verzwilligung des Kristalls ergeben eine Verbesserung des Strukturmodells. Obwohl die früher veröffentlichten Modelle und das jetzige Modell sehr ähnlich sind, so erhalten wir doch neue Informationen über die Wasserkette im cytoplasmatischen Teil zwischen Asp96 und der Schiff’schen Base. Die erhaltenen Strukturen erlauben es, in dieser Proteinfamilie Parallelen aufzuzeigen zwischen Ionentransport und der sensorischen Signalentstehung. Wichtige strukturelle Unterschiede und Ähnlichkeiten helfen zum Verständnis der Funktion dieser Proteine. Microbial rhodopsins belong to a family of seven-helical transmembrane retinal proteins which are found in Bacteria, Archaea and Eukaryota. They are considered to be the archetypes for ion transport and signal transduction, which use for these distinct functions a common structural design. The ion pumps Bacteriorhodopsin (BR) and Halorhodopsin (HR) operate as energy converters, whereas the photoreceptors Sensory rhodopsin I (SRI) and II (SRII) operate as light sensors providing the initial signal which via associated receptor-specific transducers (HtrI and HtrII) activate a two-component signalling cascade that moves the cell in response to light. The archaeal rhodopsins are the best understood proteins among seven-helical receptors with respect to structural information from X-ray crystallography. High resolution structures of Sensory rhodopsin II from Natronobacterium pharaonis and Bacteriorhodopsin from Halobacterium salinarum as well as Halorhodopsin have already been obtained. The X-ray structure of the complex between N.Pharaonis SRII (pSRII) and HtrII at 1.94 Angstrom resolution was reported. In this thesis the structure of the ground state, the early K state and the signalling late M state of Sensory rhodopsin II and its cognate transducer as well as the structure of the ground state and the late M state of the Bacteriorhodopsin were investigated by means of X-ray crystallography. Crystals were grown in the lipidic cubic phase which provided data to a resolution of 1.9 Angstrom for the ground state, 2.0 Angstrom for K state and 2.2 Angstrom for the late M state of the Sensory rhodopsin II/transducer complex and 1.35 Angstrom for the ground state, 1.5 Angstrom for the late M state of Bacteriorhodopsin. The occupancies of the intermediate states trapped in the crystals at cryo temperatures were estimated from the crystallographic analysis. The structure solution based on molecular replacement yielded atomic pictures of ground, K and M state of the pSRII/transducer complex and ground and M state of bacteriorhodopsin. The refinement scheme using simulated annealing for models consisting of two conformations (one accounting for the ground state and the other for the intermediate state) with corresponding occupancies were assessed and used for structure solution. Additionally it was investigated if experimental phases obtained by isomorphous replacement and anomalous scattering would help to determine the transducer structure including linker domain. Different models of the crystal were investigated to extract structural data for the complete fold of the transducer. Results provide insights in signal transfer from pSRII to the transducer in the membrane part of the protein complex and reveal the details of the evolvement of the proton translocation channel in BR. The observed structural changes allow to propose a mechanism for the light induced activation of the complex: Upon light excitation retinal isomerization leads in K state to a rearrangement of a water cluster that partially disconnects two helices of pSRII. In the transition to late M the changes in the hydrogen bond network proceed further. The signalling state is established by tertiary structural changes induced by the new hydrogen bond pattern and the changed charge distribution. The two partially decoupled subdomains of the receptor show a relative displacement that is most significant between helices F and G which form the interface to TM2 of the transducer. The transducer responses to the receptor activation by a clockwise rotation of about 15° of helix TM2 and a displacement of this helix by 0.9 Angstrom at the cytoplasmic surface. The late M state structure of the wild type bacteriorhodopsin extends the knowledge of this important intermediate of the photocycle reported previously. The achieved resolution of 1.5 Angstrom and the low twinning of the crystal enable a better definition of the model. Though this structure is very similar to the reported one it still provides new information particularly concerning the water molecule chain in the cytoplasmic part of the channel between Asp96 and Schiff base. The revealed structures allow drawing the parallels between ion transport and sensory signalling by this family of proteins. Important structural differences and similarities related to the function of these proteins are underlined.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	16.05.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	03.02.2006
Datum der Promotion:	03.02.2006