Dokument: Identifizierung Akt-spezifischer Funktionen im Herzen
| Titel: | Identifizierung Akt-spezifischer Funktionen im Herzen | |||||||
| Weiterer Titel: | Identification Akt-specific functions in the heart | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33910 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20150413-131751-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. rer. nat. Blasberg, Nina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Gödecke, Axel [Gutachter] Prof. Dr. Rüther, Ulrich [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Serin/Threonin Kinase Akt oder Proteinkinase B (PKB) ist ein zentraler Mediator von Proliferation, Wachstum, Überleben und Metabolismus der Zelle. Die Aktivierung der Kinase erfolgt über den Phosphatidylinositol-3-Kinase Signalweg nach Bindung entsprechender Liganden an Rezeptor-Tyrosin-Kinasen oder G-Protein gekoppelte Rezeptoren. In Säugern existieren drei Isoformen der Akt, welche trotz einer hohen Sequenzhomologie unterschiedliche Funktionen besitzen. Im Herzen werden vornehmlich Akt1 und Akt2 exprimiert. Allerdings existieren bisher kaum Daten darüber, wie die Akt-Isoformen unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen die Signaltransduktion des Herzens modulieren. Diskutiert wird hier unter anderem die Interaktion mit isoformspezifischen Substraten.
Ein Ziel dieser Arbeit war daher, Akt-assoziierte Proteinkomplexe mittels einer Kombination aus Tandemaffinitätsaufreinigung (TAP) und quantitativer Massenspektrometrie (qMS) zunächst in HEK293T Zellen und nach Etablierung der Methode in vivo im Mausherzen zu untersuchen. Dazu wurden zwei transgene Mauslinien etabliert, welche zusätzlich zur endogenen Akt-Isoform ein Akt1- bzw. Akt2 N-TAG Fusionsprotein für die TAP spezifisch in Kardiomyozyten exprimierten. Da nur geringe Proteinspiegel von Akt2 N-TAG im Herzen vorlagen, erfolgte die TAP nur an Akt1 N-TAG Mäusen. So wurden mittels der TAP/qMS-Methode neben bereits bekannten (HSP90), auch neue Akt1-Interaktionspartner wie ATP-Synthase, Phgdh (D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase), Myosin-bindendes Protein C, Serca und Glutathionperoxidase 1 identifiziert. Unter diesen wurden ATP-Synthase und Phgdh mit PLA (Proximity Ligation Assay) verifiziert. Die quantitative MS-Analyse zeigte, dass Akt1 überwiegend transiente Interaktionen eingeht. In weiteren Untersuchungen wurden die Folgen der Akt1 N-TAG Überexpression echokardiographisch und histologisch in Mäusen unterschiedlicher Altersstufen untersucht. Dabei zeigte sich bei den transgenen Akt1 N-TAG Mäusen im Alter von neun Monaten eine milde Hypertrophie ohne interstitielle Fibrosierung, welche allerdings nicht mit einer vermehrten Kapillarbildung einherging, was womöglich Ursache einer eingeschränkten Pumpfunktion dieser Herzen war. In einem weiteren Ansatz wurden die funktionellen Konsequenzen einer Deletion der Akt1- bzw. der Akt2-Isoform im Herzen unter Isoproterenol-induziertem β-adrenergem Stress in ubiquitären Akt1 knockout (KO1) bzw. Akt2 (KO2)-Mäusen, sowie in induzierbaren kardiomyozytenspezifischen Akt1 KO-Mäusen (ICM KO1) mittels Echokardiographie, Strain-Analyse und Histologie untersucht. Dabei führte in beiden KO-Modellen nur das Fehlen der Akt1-Isoform zu einer signifikanten Einschränkung der kardialen Pumpfunktion. Allerdings entwickelten nur KO1-Mäuse in diesem Kontext ein maladaptives kardiales Remodeling. Schlussfolgerung: Mittels TAP/qMS können Akt1-assoziierte Proteine sowohl im Zellkultur-basierten Ansatz, als auch in vivo im Herzen identifiziert werden. Die Überexpression von Akt1 N-TAG induziert auch nach langfristiger Expression nur einen milden kardialen Phänotyp, weiterhin führt die Deletion von Akt1, nicht aber Akt2 unter β-adrenergem Stress zu maladaptiven Folgen für das Herz hinsichtlich systolischer Pumpfunktion und Remodeling. Inwieweit die hier erstmalig identifizierten Interaktionspartner von Akt1 an der kardialen Dysfunktion beteiligt sind, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden.The serine/threonine kinase Akt or protein kinase B (PKB) is a central mediator of proliferation, growth, survival and metabolism of the cell. Akt is activated via the phosphatidyl-inositol-3-kinase pathway after binding of specific ligands to receptor tyrosine kinases or G protein-coupled receptors. In mammals, three distinct isoforms have been described which share a high degree of sequence homology but exert specific functions. In the heart, Akt1 and Akt2 are the predominantly expressed isoforms. So far, less is known about how these two isoforms modulate cardiac signal transduction pathways under physiological or pathological conditions. Possible mechanisms discussed are interactions of Akt with isoform specific substrates. Thus, one aim of this work was to analyze Akt-associated proteins by combining tandem affinity purification (TAP) and quantitative mass spectrometry (qMS) in HEK293T cells and after establishment of the method in vivo in transgenic mouse hearts. Therefore, two transgenic mouse lines were established, that express recombinant Akt1- or Akt2 N-TAG proteins in cardiomyocytes in addition to the endogenous Akt isoform. Due to low protein levels of Akt2 N-TAG in the heart, TAP experiments were only performed with Akt1 N-TAG mice. TAP/qMS-analysis revealed besides already known interaction partners (HSP90), also new Akt1 interacting proteins like ATP-Synthase, Phgdh (d-3-phosphoglycerate dehydrogenase), myosin-binding protein C, Serca and glutathione peroxidase 1. Among these ATP synthase and Phgdh were verified successfully by PLA (Proximity Ligation Assay). Quantitative MS-analysis showed that Akt1 predominantly forms transient interactions with its substrates. In further experiments the consequences of Akt1 N-TAG overexpression were analyzed by echocardiography and histology in mice of different age. Transgenic mice at nine month of age developed a mild hypertrophy without fibrosis. However, myocardial capillary density was decreased, which may explain reduced contraction in the hearts of Akt N-TAG mice. Furthermore, functional consequences for the heart due to Akt1 or Akt2 deletion were investigated in an isoproterenol induced β-adrenergic cardiac stress model in constitutive Akt1 knockout (KO1) and Akt2 (KO2) mice, respectively. In addition inducible cardiomyocyte specific Akt1 KO mice (ICM KO1) were used. Deletion of Akt1 caused a significant reduction in cardiac systolic function both in KO1 and ICM KO1 mice. Akt2 KO mice were not affected. However, only KO1 mice developed a maladaptive cardiac remodeling. Conclusion: TAP/qMS is a potent tool to identify Akt1 associated proteins in cell culture as well as in vivo in mouse hearts. Even long term overexpression of Akt1 N-TAG in the heart induced only a mild cardiac phenotype, whereas deletion of Akt1 but not Akt2 in the heart had maladaptive consequences during induced β-adrenergic stress concerning systolic function and cardiac remodeling. To what extend the novel Akt1 interaction partners may contribute to that phenotype remains to be elucidated. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.04.2015 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.04.2015 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 23.06.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.10.2014 |
