Dokument: Flavinmononukleotid-basiertes Fluoreszenzprotein als Reporter hypoxischer Genexpression in Pilzen

Titel:	Flavinmononukleotid-basiertes Fluoreszenzprotein als Reporter hypoxischer Genexpression in Pilzen
Weiterer Titel:	Flavin mononucleotide-based fluorescent protein as a reporter of hypoxic gene expression in fungi
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33753
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150318-104642-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Eichhof, Isabel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,47 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.03.2015 / geändert 17.03.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Apathogene Pilze wie der Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae werden in der Grundlagenforschung und für biotechnologische Anwendungen genutzt, während der humanpathogene Pilz Candida albicans dem menschlichen Wirt durch schwere Infektionen schadet. Die Anpassung an sauerstofflimitierende Umgebungen ist für das Wachstum beider Typen der Pilze von Bedeutung. Da verfügbare Fluoreszenzreporter, wie das „Grün Fluoreszierende Protein“ (GFP) und dessen Varianten, nur unter aeroben Bedingungen emittieren, wurde in dieser Arbeit die Verwendung des sauerstoff-unabhängigen „C. albicans Flavinmononukleotid-basierten Fluoreszenzproteins“ (CaFbFP) als Reporterprotein in S. cerevisiae und C. albicans etabliert. Die Fluoreszenzintensität von CaFbFP konnte durch Mehrfachfusionen des Proteins erhöht werden. So führte eine Tandemfusion aus zwei CaFbFP-Proteinen (2xCaFbFP) bei S. cerevisiae zu einer Steigerung der Fluoreszenzintensität und bei C. albicans verstärkte eine vierfache Fusion (4xCaFbFP) die Intensität ebenfalls deutlich. Unter Verwendung der Tandemfusionen 2xCaFbFP und 4xCaFbFP wurde die Fluoreszenz des Proteins erstmals in Einzelzellen von C. albicans gezeigt. In Analysen der pH-abhängigen Fluoreszenz generierte CaFbFP im Gegensatz zu dem Referenzprotein CaYFP auch im sauren pH-Bereich signifikante Fluoreszenz. Neben seiner Lokalisation und Funktion im Cytoplasma wurde die Aktivität von CaFbFP in verschiedenen Hefezellkompartimenten untersucht. Ein Fusionsprotein, bestehend aus CaFbFP und Histon H2B, war in Zellkernen von S. cerevisiae und C. albicans lokalisiert und wurde durch seine Fluoreszenz nachgewiesen. Um die Sekretion und Oberflächen-lokalisation von CaFbFP in Hefen zu erreichen, wurden Transformanden von S. cerevisiae konstruiert, die eine Fusion aus dem Zellwand-assoziierten Aga2-Protein und CaFbFP synthetisieren. Die Biosynthese, Lokalisation an der Zelloberfläche und die Fluoreszenz dieses Fusionsproteins konnten nachgewiesen werden. Immunoblot-Analysen ließen außerdem eine partielle Prozessierung der Aga2-CaFbFP-Fusion erkennen, wobei eine proteolytische Schnittstelle im N-terminalen Bereich von CaFbFP vermutet wird. Die Beteiligung der Protease Kex2 konnte durch Mutation eines potentiellen Kex2-Erkennungsmotivs ausgeschlossen werden. Zur Analyse sauerstoffabhängiger Prozesse in Hefe wurden Expressionsvektoren für Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) -basierte Sauerstoff-Sensoren konstruiert (YFOS, Yeast Fluorescent Oxygen Sensor). Diese Sensoren sind Fusionsproteine, bestehend aus dem sauerstoffunabhängigen Donorchromophor CaFbFP (S. cerevisiae) bzw. 2xCaFbFP (C. albicans) und dem sauerstoffabhängigen Akzeptorprotein CaYFP. In Transformanden von S. cerevisiae und C. albicans wurde durch Immunoblot- und Fluoreszenzanalysen die Funktionalität dieser FRET-Systeme gezeigt. Bei S. cerevisiae-Transformanden wurde der YFOS-Sensor durch Fluoreszenzmessungen bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen kalibriert und erwies sich als geeignet, intrazelluläre Sauerstoff-konzentrationen zu bestimmen. Fluoreszenzanalysen erbrachten außerdem den Nachweis, dass das YFOS Sensor-System bei S. cerevisiae auf der Zelloberfläche lokalisiert werden kann und dort funktionell ist. Möglicherweise könnte die Aktivität eines solchen FRET-Systems auf der Zelloberfläche von C. albicans daher Aufschluss über Sauerstoff-bedingungen im menschlichen Wirt geben. Zusammenfassend haben die Ergebnisse gezeigt, dass das CaFbFP-Protein als fluoreszierender Reporter unter hypoxischen Bedingungen in Hefen genutzt werden kann und dadurch neue Möglichkeiten für die Erforschung hypoxischer Prozesse in diesen eukaryotischen Organismen bietet. Apathogenic fungi like the model organism Saccharomyces cerevisiae are used in basic research and for biotechnological purposes, while the human pathogenic fungus Candida albicans affects the human host by severe infections. The adaption to oxygen-limited environments is of importance for both types of fungi. Because available fluorescence reporters like the “Green Fluorescent Protein” (GFP) and its variants emit only under aerobic conditions, the use of oxygen-independent „C. albicans Flavin-mononucleotide-based Fluorescent Protein“ (CaFbFP) was established in this dissertation as a reporter protein in S. cerevisiae and C. albicans. The fluorescence intensity of CaFbFP could be increased by multiple fusions of the protein. Thus, in S. cerevisiae, a tandem fusion of two CaFbFP proteins (2xCaFbFP) led to an increase of fluorescence intensity, while in C. albicans, a fourfold fusion (4xCaFbFP) also enhanced the intensity significantly. Using the tandem fusions 2xCaFbFP and 4xCaFbFP the fluorescence of the protein was shown for the first time in single cells of C. albicans. In analyses of the pH-dependent fluorescence CaFbFP generated significant fluorescence also in the acidic pH-range in contrast to the reference protein CaYFP. Besides its localization and functionality in the cytoplasm the activity of CaFbFP was investigated in different yeast cell compartments. A fusion protein consisting of CaFbFP and histone H2B was located in the nuclei of S. cerevisiae and C. albicans and was detected by its fluorescence. To achieve secretion and surface localization of CaFbFP in yeast S. cerevisiae transformants were constructed that synthesized a fusion of the cell wall-associated Aga2 protein to CaFbFP. Biosynthesis, localization on the cell surface and fluorescence of the fusion protein could be shown. Additionally, immunoblot analyses revealed partial processing of the Aga2-CaFbFP fusion, which presumably was due to a proteolytic cleavage site located in the N-terminal part of CaFbFP. Involvement of the protease Kex2 could be excluded by mutation of a potential Kex2 recognition motif. To analyze oxygen-dependent processes in yeast, expression vectors for fluorescence resonance energy transfer (FRET) –based oxygen-sensors (YFOS, Yeast Fluorescent Oxygen Sensor) were constructed. These sensors are fusion proteins consisting of the oxygen-independent donor chromophore CaFbFP (S. cerevisiae) and 2xCaFbFP (C. albicans), respectively, and the oxygen-dependent acceptor chromophore CaYFP. The functionality of these FRET systems could be shown in transformants of S. cerevisiae and C. albicans by immunoblot and fluorescence analyses. In S. cerevisiae transformants the YFOS sensor was calibrated by fluorescence measurements at different oxygen concentrations and was found to be suitable for the determination of intracellular oxygen concentrations. Furthermore, fluorescence analyses provided evidence that the YFOS sensor system can be located and be functional on the yeast cell surface. Possibly, the activity of such a FRET-based system on the cell surface of C. albicans will provide information on oxygen conditions in the human host. In summary, the results show that the CaFbFP protein can be used as fluorescent reporter under hypoxic conditions in yeasts, thus offering new possibilities for research of hypoxic processes in these eukaryotic organisms.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	18.03.2015
Dateien geändert am:	18.03.2015
Promotionsantrag am:	03.02.2014
Datum der Promotion:	24.03.2014