Dokument: Molekulare in vitro Analyse des humanen ABC Transporters MDR3

Titel:	Molekulare in vitro Analyse des humanen ABC Transporters MDR3
Weiterer Titel:	Molecular in vitro analysis of the human ABC transporter MDR3
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33323
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150205-101704-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kluth, Marianne [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,39 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.02.2015 / geändert 05.02.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Betreuer/Doktorvater] Keitel-Anselmino, Verena [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die ATP-abhängige Sekretion von Phosphatidylcholin in die Gallenkanälchen der Leber ist ein wichtiger Prozess bei der Gallenbildung und wird durch das multidrug resistance protein 3 (MDR3), das auch als ATP-binding cassette subfamily B member 4 (ABCB4) bezeichnet wird, vermittelt. Die Fehlfunktion von MDR3 führt von der Gallensteinbildung bis hin zu schwerwiegenden Lebererkrankungen. Interessanterweise weist MDR3 eine 86%ige Sequenzhomologie mit dem Multi-Drogenresistenz-vermittelnden ABC-Transporter MDR1 (ABCB1) auf. Jedoch ist die molekulare Funktionsweise von MDR3, aufgrund der Schwierigkeit humane ABC Transporter in ausreichenden Mengen für biochemische Analysen zu exprimieren und zu reinigen, bis heute noch weitgehend unverstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression in Pichia Pastoris und die Reinigung von MDR3 etabliert. Zu diesem Zweck wurden über 100 verschiedene Detergenzien in Bezug auf ihre Fähigkeit MDR3 aus der Membran zu extrahieren analysiert und die Monodispersität des im Detergenz gelösten MDR3-GFP-Fusionsproteins mittels Fluoreszenz-basierter Größenausschlusschromatographie untersucht. Das beste Resultat wurde mit dem zwitterionischen Detergenz Fos-Cholin-16 erhalten, das für die weitere Reinigung von wildtypischem MDR3 und die, in dieser Arbeit untersuchten Mutanten, verwendet wurde. Die ATPase Aktivität von wildtypischem MDR3 wurde bezügliche kinetischer Parametern, Substratspektrum und die Inhibition durch Phosphatanaloga untersucht. Die Anwesenheit von Phosphatidylcholin (PC) führte zu einer zweifachen Stimulation, während die Lipide Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS) und Sphingomyelin (SM) die ATPase Aktivität von MDR3 nicht stimulierten. Des Weiteren hemmte die Quervernetzung von MDR3 mit einem thiol-reaktiven Fluorophor die PC-stimulierte und basale ATPase Aktivität von MDR3. Auf Basis der substratstimulierten ATPase Aktivität von MDR3 war es nun möglich, die klinisch relevante Mutation Q1174E auf funktioneller Ebene zu untersuchen. Die Substitution des Glutamins zu Glutamat im erweitertem X-Loop Motiv führte zur Aufhebung der substratstimulierten ATPase Aktivität, während die basale ATPase Aktivität erhalten blieb. Darüber hinaus zeigte die Analyse des Strukturmodells von MDR3, dass das Glutamin an der Weiterleitung der durch die Bindung und Hydrolyse von ATP an der Nukleotid-Bindestelle (NBS) resultierenden Konformationsänderung zur Transmembrandomäne (TMD) beteiligt ist und somit eine wichtige Rolle in der Kommunikation zwischen der Nukleotid-bindende Domäne (NBD) und der TMD spielt. In einer vorangegangenen Studie wurde gezeigt, dass MDR3 eine Anzahl von zytotoxisch Pharmazeutika mit niedriger Rate transportiert, aber bis heute wurde ein Beitrag von MDR3 an der Multi-Drogenresistenz von Krebszellen nicht nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die ATPase Aktivität von MDR3 bezüglich der Modulation durch Pharmazeutika untersucht. Keines der ausgwählten Pharmazeutika stimulierte die ATPase Aktivität von MDR3. Im Gegenteil, die ATP Hydrolyse wurde durch Cyclosporin A, Verapamil, Paclitaxel, Zosuquidar und Itraconazol inhibiert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das Pharmakon die Funktion von MDR3 blockiert. Im Weiterem befasste sich diese Arbeit mit der Regulation der Zelloberfläschenexpression von MDR3. Für die Funktion von MDR3 ist die Lokalisation des Transporters an der kanalikulären Membran unabdingbar. Radixin wurde als neuer Interaktionspartner identifiziert, der die Interaktion von MDR3 mit dem Zytoskelett vermittelt. Zusammenfassend lieferte diese Arbeit neue Einblicke in die Wirkungsweise des menschlichen ABC-Transporter MDR3. The ATP-dependent secretion of phosphatidylcholine into the liver bile canaliculi is an important process of bile formation and is mediated by the multidrug resistance protein 3 (MDR3), also called ATP-binding cassette subfamily B member 4 (ABCB4). Dysfunction of MDR3 causes liver diseases from the range of gallstones to serious cholestasis. Interestingly, MDR3 shares 86% homology with the multidrug resistance (MDR) mediating ABC transporter MDR1 (ABCB1) in the amino acid sequences. However, due to the difficulty to express and purify human ABC transporters in sufficient quantities for biochemical analysis the molecular mechanism of MDR3 is still poorly understood. In this thesis the expression in Pichia pastoris and the purification of MDR3 was established. For this purpose, over 100 different detergents were analysed with respect to the efficacy to solubilize MDR3 from membrane vesicles. The monodispersity of detergent-soluble GFP-fusion protein of MDR3 was investigated using fluorescence-detected size exclusion chromatography. The best result was obtained with the zwitterionic detergent Fos-choline-16, which was subsequently used to purify wild type MDR3 and mutants investigated in this study. The ATPase activity of wild type MDR3 in detergent solution was analyzed in terms of kinetic parameters, substrate spectrum and effects of phosphate analoga. The presence of phosphatidylcholine induced a two-fold stimulation, while phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS) and sphingomyelin (SM) lipids did not stimulate the ATPase activity of MDR3. Furthermore, the crosslinking of MDR3 with a thiol-reactive fluorophore abolished PC-induced and basal ATPase activity. The substrate-induced ATPase activity of MDR3 provides the foundation to investigate the clinical relevant Q1174E mutation at the functional level. The substitution of glutamine to glutamate within the extended X-loop of the nucleotide-binding domain 2 (NBD2) abolished substrate-induced ATPase activity, but not basal activity. In addition, the analysis of the homology model of MDR3 suggested that the glutamine participated in the transduction of the conformational change as a result of binding and hydrolysis of ATP at the nucleotide-binding site (NBS) to the transmembrane domain (TMD) and consequently plays an essential role in the communication between NBD and TMD. In a previous study, it was demonstrated that MDR3 transports cytotoxic drugs with low-level rate. However, up to date MDR3 shows no phenotype with respect to MDR. In this thesis, the drug-modulated ATPase activity was analyzed. None of the tested drugs stimulated the basal ATPase activity of MDR3. Contrary, ATP hydrolysis was inhibited by cyclosporin A, verapamil, paclitaxel, zosuquidar and itraconazole indicating that drug binding blocks MDR3. Furthermore, the regulation of the cell surface expression of MDR3 was investigated. For MDR3 function, the localization of the transporter at the canalicular membrane is indispensable. Radixin was identified as new adaptor protein mediating the interaction of MDR3 with the cytoskeleton.In summary, this thesis highlights new insights into the mode of action of the human ABC transporter MDR3.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	05.02.2015
Dateien geändert am:	05.02.2015
Promotionsantrag am:	28.10.2014
Datum der Promotion:	29.01.2015