Dokument: Untersuchung der Katalyseeigenschaften und strukturellen Dynamik von Proteinen und Proteinkomplexen mit Einzelmolekül- Fluoreszenzspektroskopie
| Titel: | Untersuchung der Katalyseeigenschaften und strukturellen Dynamik von Proteinen und Proteinkomplexen mit Einzelmolekül- Fluoreszenzspektroskopie | |||||||
| Weiterer Titel: | Investigation of the catalytic properties and structural dynamics of proteins and protein complexes with single-molecule fluorescence spectroscopy | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33261 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20150130-091337-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Rohrbeck, Daniel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Seidel, Claus A. M. [Gutachter] Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Funktionalität von Proteinen ist abhängig von Struktur und Flexibilität. Diese befinden
sich dabei in einer kontinuierlichen Bewegung zwischen verschiedenen konformellen Zuständen vergleichbarer Energien. Bestimmte Trigger, wie Liganden, beeinflussen dieses Gleichgewicht, indem sie konformelle Strukturänderungen des Proteins induzieren. Grundlegende Proteindynamiken sind die Scharnier- und Scherbewegungen, jedoch existieren auch komplexere Bewegungsabläufe, wie Domäneninteraktionen mit verschiedenen aktiven Zentren oder partieller Entfaltung. Untersuchungen dieser konformellen Änderungen und deren Dynamik liefern Rückschlüsse auf den funktionellen Ablauf. Für diese Arbeit wurde mit fluoreszenzspektroskopischen Methoden die strukturelle Dynamik von Proteinen an vier verschiedenen Modellsystemen untersucht. Ein Vertreter der Liganden-induzierten Scharnierbewegung ist die homodimere Anthranilat- Phosphoribosyltransferase aus dem hyperthermophilen Sulfolobus solfataricus (ssAnPRT). Es wurden Cystein-Proteinvarianten zur Fluoreszenzmarkierung gefunden, die ein dynamisches Proteinkonstrukt aufzeigten. Die Magnesium-induzierte Scharnierbewegung des Enzyms liegt bei Raumtemperatur im Mikrosekunden-Bereich und wurde mit einer Kombination aus Photon Distribution Analysis und Fluoreszenzkreuzkorrelation verifiziert. Somit war es möglich, ein dynamisches Modell der Katalyse für ssAnPRT zu entwickeln. Die Nukleotid-bindende Domäne (NBD) des aus Lactococcus lactis stammenden integralen Membranproteins Lactococcal multidrug resistance protein A (LmrA) ist ein weiterer Vertreter von Proteinen der Scharnierbewegung. Zudem wurde für die Transmembran- Domäne (TMD) eine Scherbewegung vermutet. Dynamische Strukturänderungen während des Transportzyklus von Substraten konnten gezeigt werden. Ein Modell des Transportmechanismus ist weiterhin unbekannt. Das Postsynaptic Density Protein 95 (PSD-95) gehört zu den Membran-assoziierten Guanylat- Kinasen. Aufgrund seiner Eigenschaft als Gerüstprotein ist es ein hochdynamisches Proteinkonstrukt, dessen vernetzende Eigenschaften mit anderen Proteinen ein wichtiges Element der Signaltransduktion ist. Mit Hilfe der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie und der damit assoziierten Spezies-selektiven Fluoreszenzkreuzkorrelation konnte die Proteindynamik quantifiziert und ein Modell der Domänenverknüpfungen etabliert werden. Im letzten Teilprojekt wurde am Lysozym des T4 Phagen der strukturelle und dynamische Entfaltungsprozess untersucht. Während der Harnstoff-induzierten Denaturierung konnten Intermediatzustände nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Hinweise auf den sogenannten „communication link“ zwischen Helix A und E der N- und C-terminalen Subdomänen gefunden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass bei vollständiger Denaturierung das Protein nicht strukturlos ist, sondern eine neue Sekundär-strukturlose Tertiär- oder Quartärstruktur existiert.The functionality of proteins depends on the structure and flexibility. They are thereby a part of a continuous movement between different conformational states of comparable energies. Certain triggers, such as ligands, influence this balance by inducing conformational structural changes of the protein. Basic protein dynamics are the hinge and shear motions, although more complex movement sequences such as domain interactions with different active centres or partial unfolding exist. The analysis of these conformational changes und their dynamics allows for conclusions about the functional process. For the analysis the structural dynamics of proteins has been analysed with fluorescence spectroscopic methods in four different model systems. One representative of the ligands induced hinge motion is the homodimeric anthranilate phosphoribosyl transferase from the hyperthermophile Sulfolobus solfataricus (ssAnPRT). Cysteine protein variants for fluorescent labelling were found, which indicate a dynamic protein construct. The magnesium induced hinge motion of the enzyme is in the range of microseconds at room temperature und was verified by a combination of Photon Distribution Analysis and Fluorecence-Crosscorrelation. Hence, it was possible to develop a dynamic model of the catalysis for ssAnPRT. The nucleotide-binding domain (NBD) of the integral membrane protein Lactococcal multidrug resistance protein A (LmrA), which stems from Lactococcus lactis, is another representative of proteins of hinge motions. In addition to this, a shear motion was suspected for the transmembrane domain (TMD). Dynamic structural changes during the transport cyclus of the substrates could be shown. However, a model of the transport mechanism is still unknown. The postsynaptic density protein 95 (PSD-95) belongs to the membrane-associated guanylate kinases. Due to its characteristic as a scaffold protein it is a highly dynamic protein construct whose linking characteristic with other proteins is an important element of signal transduction. By means of the single molecule fluorescence spectroscopy and the speciesselective fluorescence cross-correlation associated with it, the protein dynamic was quantified and a model of domain connections was established. In the last sub-project the aim was to analyse the structural and dynamic unfolding process at the lysozyme of phage T4. During urea-induced denaturation intermediate states have been suggested. Furthermore, indications of the so-called “communication link” between helix A and E of the N- and C-terminal sub-domains were detected. It has also been established that the protein is not without structure upon complete denaturing, as a new tertiary or quaternary structure without secondary structure exists. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Physikalische Chemie und Elektrochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.01.2015 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.01.2015 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 02.06.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 26.08.2014 |
