Dokument: Charakterisierung mitochondrialer Pentatricopeptid-repeat-Proteine aus Neurospora crassa

Titel:	Charakterisierung mitochondrialer Pentatricopeptid-repeat-Proteine aus Neurospora crassa
Weiterer Titel:	Characterisation of mitochondrial pentatricopeptide repeat proteins from Neurospora crassa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33237
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150127-103945-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Moseler, Ricarda [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,36 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.01.2015 / geändert 26.01.2015
Stichwörter:	Pentatricopeptid-repeat-Proteine, Atmungskettenkomplex I, Neurospora crassa, Biogenese
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Pentatricopeptid-repeat-Proteine sind eukaryotenspezifische Proteine, die in verschiedene Schritte der Genexpression in Organellen involviert sind. Sie werden charakterisiert durch ein degeneriertes Motiv aus 35 Aminosäuren, welches bis zu 30 mal in Tandemanordnung innerhalb eines Proteins vorkommt. Seit ihrer Entdeckung im Jahr 2000, liegt das Ziel in der Aufklärung der Funktion und Struktur dieser neuen Proteinfamilie. In dem Modellorganismus Neurospora crassa wurden neun PPR-Proteine identifiziert, welche bereits in vorangegangenen Arbeiten mit Hilfe von Deletionsmutanten untersucht wurden. In den Mutanten der Gene ncu06461 sowie ncu07684 zeigten sich Defekte in der korrekten Assemblierung vom Atmungskettenkomplex I sowie Veränderungen in der Prozessierung bzw. Synthese von Transkripten für mitochondrial kodierte Untereinheiten des Membranarms. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein direkter Zusammenhang zwischen Komplex-I-Defekt und der Abwesenheit der Gene ncu06461 sowie ncu07684 über die erfolgreiche Komplementation der Deletionsmutanten hergestellt, welche durch eine wiederhergestellte Komplex-I-Aktivität nachgewiesen wurde. Anschließend erfolgte die funktionelle Charakterisierung dieser Proteine. Nach Optimierung war es möglich, die Gene heterolog in Escherichia coli als Fusionsproteine mit C-terminalem His-tag ohne mitochondriale Präsequenz und unter Anwendung von osmotischem Stress und Hitzeschock zu exprimieren. Die Proteinisolierung wurde in einem einstufigen Prozess mittels immobilisierter Metallionen Affinitätschromatographie durchgeführt. Mit dem Protein ∆95-ncu06461-His wurden Kristallisationsversuche durchgeführt, welche der Bestimmung der Strukturanalyse des Proteins mittels Röntgenbeugung dienen sollen. In Retardierungsanalysen wurde die spezifische Bindung des Proteins ∆95-ncu06461-His an das RNA-Fragment am Exon-Intron-Übergang des Transkripts für die Untereinheit ND4 des Komplex I in Anwesenheit von Magnesium-Ionen nachgewiesen. Ein Einfluss des Proteins auf die Spleißvorgänge des ND4-Introns wird folglich vermutet. Die Funktion des Proteins liegt vermutlich in der Bindung katalytisch aktiver RNA-Strukturen, um die Rekrutierung von Effektorproteinen zum Transkript zu ermöglichen. Pentatricopeptide repeat (PPR) proteins are eukaryote specific proteins implicated in various steps of organellar gene expression. They are characterised by a degenerated 35 amino acid motif, which can be repeated in tandems up to 30 times. Since the discovery of the Pentatricopeptide repeat (PPR) proteins in the year 2000, the aim is to decipher the function and structure of this new protein family. Nine PPR proteins have been identified in the model organism Neurospora crassa and have been examined in previous studies by means of knockout mutants. Mutants of the genes ncu06461 and ncu07684 revealed defects in the assembly of respiratory chain complex I as well as changes in the processing respectively synthesis of transcripts for subunits of the membrane arm. This work confirms a direct link between the absence of the genes ncu06461 and ncu07684 and the defect in complex I via complementation mutants, where the formation of complex I was restored. Subsequently these proteins were characterised functionally. After optimisation it was possible to heterologously express the proteins as fusion proteins with a C-terminal His-tag without their mitochondrial presequence using osmotic stress and heatshock. The proteins were purified in a one-step approach via immobilised metal ion affinity chromatography. Attempts towards structure determination via x-ray diffraction were carried out by crystallising protein ∆95-ncu06461-His. Gel retardation analysis revealed an interaction between the protein ∆95-ncu06461-His and an RNA fragment consisting of the exon/intron junction of transcript for subunit ND4 of respiratory chain complex I in the presence of magnesium ions. An influence of the protein on splicing of the ND4 intron is assumed. The protein may function by binding to catalytic active RNA structures to target effector proteins to the transcript.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	27.01.2015
Dateien geändert am:	27.01.2015
Promotionsantrag am:	09.12.2014
Datum der Promotion:	16.01.2015