Dokument: Exploring the full sequence landscape of Bacillus subtilis lipase A towards thermostability and detergent resistance
| Titel: | Exploring the full sequence landscape of Bacillus subtilis lipase A towards thermostability and detergent resistance | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33217 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160210-085916-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Fulton, Alexander [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Bacillus subtilis, Lipase, BSLA | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Biokatalyse stellt eine umweltfreundliche Alternative zur herkömmlichen chemischen Katalyse dar. Allerdings sind Biokatalysatoren Enzyme, die natürlicherweise nicht daran angepasst sind unter chemischen Verfahrensbedingungen, z.B. in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, Detergenzien, oder ionischen Flüssigkeiten, verwendet zu werden. Diese Verbindungen beeinflussen die Hydrathülle und die elektrostatischen Wechselwirkungen des Proteins, welches letztendlich zu Aggregation und Verlust der enzymatischen Aktivität führen kann. Methoden der gelenkten Proteinevolution können die Proteinstabilität für diese Bedingungen erhöhen. Gegenwärtige Ansätze verwenden dabei semi-rationale Strategien um Durchmusterungsanstrengungen auf dafür bekannte Bereiche des Proteins zu konzentrieren. Allerdings beruhen diese Überlegungen grundsätzlich auf publizierten Ergebnissen, die wahrscheinlich nicht alle für die Optimierung wichtigen Bereiche des Proteins identifizieren konnten, da sie aus mehreren Gründen nicht repräsentativ sind: (I) decken diese Experimente nicht den gesamten Sequenzraum des Proteins ab und sind in der Auswahl der substituierenden Aminosäure eingeschränkt (z.B. epPCR, Ala-Scanning-Mutagenese). (II) beschränken sich die Ergebnisse vornehmlich auf die prominentesten Varianten, in denen oft eine Vielzahl von Mutationen eingebracht wurden, sodass wertvolle Informationen über den Einfluss der einzelnen Mutationen und additive Effekte fehlen. (III) berichten publizierte Ergebnisse meist nur von Mutationen mit dem größten positiven Einfluss, ohne Informationen über den Beitrag von Aminosäure-Substitutionen mit geringeren, neutralen oder negativen Auswirkungen.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine vollständige Sättigungsmutagenese durchgeführt, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten und um den vollständige Sequenzraum eines Modellenzyms zu erfassen. Dadurch werden alle bereits erwähnten experimentellen Beschränkungen aufgehoben. Die Lipase BSLA (kodiert durch das Gen lipA aus Bacillus subtilis) wurde als Modellenzym ausgewählt. BSLA ist die kleinste bekannte α-/β-Hydrolase, biochemisch charakterisiert, mit bekannter Kristallstruktur und nachgewiesenem biotechnologischen Potential. Mehrere Durchmusterungsexperimente wurden durchgeführt, um jede Enzymvariante in Bezug auf Stabilität gegenüber erhöhten Temperaturen, Änderungen in der bevorzugten Fettsäurekettenlänge und Resistenz gegenüber verschiedenen Arten von Tensiden zu charakterisieren. Der resultierende Datensatz dient nun zur Identifizierung aller Aminosäurepositionen der BSLA, welche für die Stabilität oder die Aktivität der BSLA und somit als Ziel für Proteinoptimierung von Bedeutung sind. Diese Ergebnisse besitzen großes Potenzial für rationale Strategien hinsichtlich der maßgefertigten Anpassung von Biokatalysatoren auf die jeweiligen Prozessbedingungen.Biocatalysis represents an environmentally friendly alternative to traditional chemical catalysis. However, biocatalysts are enzymes which have not been evolved by nature to operate under chemical process conditions, i.e. in the presence of organic solvents, surfactants, or ionic liquids. These compounds can interfere with the protein water shell, disturb electrostatic interactions and thus lead to unfolding, aggregation, and finally loss of enzymatic activity. Protein stability under these conditions can be increased by means of directed evolution. Current approaches, however, tend to apply semi-rational design with small library sizes to limit the screening effort by targeting sites of a protein known to be important for stability. After all, rationales applied to date are derived from results which most likely failed to identify all potential sites for optimization since they are biased in many ways. (I) The experiments are usually designed with only limited coverage along the protein sequence or with respect to the substituted amino acids (e.g. epPCR, Ala-scanning mutagenesis). (II) The results only contain the most prominent variants with multiple mutations, leaving out valuable information about the influence of single mutations and additive effects. (III) The results only cover mutations with the highest positive impact but give no information about sites which only show little, none, or negative effects. A full site saturation mutagenesis was generated to ensure complete coverage to capture the full sequence landscape of a model enzyme avoiding all of the mentioned limitations. The lipase BSLA (encoded by the gene lipA from Bacillus subtilis) was chosen as model enzyme. BSLA is a minimal α-/β-hydrolase and is biochemically well characterized, its crystal structure is known, and its biotechnological potential has been demonstrated. Multiple screening experiments were performed to characterize each variant in respect to stability against elevated temperatures, changes in the preferred fatty acid chain length, and resistance against different types of surfactants. The resulting dataset can now be used to identify all amino acids of BSLA involved in resistance and thus provide targets for protein engineering strategies. The results hold great potential to advance rational engineering strategies towards the customized design of a given biocatalyst under defined process conditions. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.02.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.02.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 14.10.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 03.12.2014 |
