Dokument: Biochemische Charakterisierung der Oligomerisierung des Interferon-gamma-induzierten humanen Guanylat-bindenden Proteins I

Titel:	Biochemische Charakterisierung der Oligomerisierung des Interferon-gamma-induzierten humanen Guanylat-bindenden Proteins I
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3321
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20060205-001321-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Benscheid, Utz [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter] Prof. Dr. Alfermann, August-Wilhelm [Gutachter] Prof. Dr. Herrmann, Ch. [Gutachter]
Stichwörter:	humanes Guanylat-bindendes Protein 1, Selbst-Assemblierung, GTPase-Domäne, helikale-Domäne, Hefe-2-Hybrid-System, Differential Scanning Kalorimetrie, Isotherme Titrationskalorimetrie, cross-linkinghuman Guanylate-Binding Protein 1, self-association, GTPase-domain, helical domain, yeast 2 hybrid-system, Differential Scanning Calorimetry, Isothermal Titration Calorimetry, cross-linking
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Ziel dieser Arbeit war die biochemische und biophysikalische Charakterisierung der Selbst-Assemblierung des humanen Guanylat-bindenden Proteins 1. Vor allem wurde der Beitrag von verschiedenen Aminosäurenseitenketten sowie die Funktion der G-Domäne und der helikalen Domäne von hGBP1 untersucht. In einer vorangegangenen Arbeit wurde die Struktur des Wildtyp-Proteins von hGBP1 mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt. In der Anwesenheit des GTP-Analogons GppNHp kristallisiert das Protein mit einem Molekül pro asymmetrischer Einheit. Anhand der Kristallkontakte identifizierten die Autoren zwei vorläufige Modelle des Dimers, die für diese Arbeit als Arbeitshypothese dienten. Mit dem Hefe 2-Hybrid-System konnte gezeigt werden, dass es die in dem einen Modell vorgeschlagene Interaktion zwischen der G-Domäne und der helikalen Domäne nicht gibt. Jedoch konnte die in dem zweiten Modell vorgeschlagene Interaktion zwischen den G-Domänen konnte mit dem 2-Hybrid-System und mit verschiedenen biochemischen Methoden wie der analytischen Größenausschlusschromatographie und durch die kovalente Verknüpfung mit chemischen Cross Linkern bewiesen werden. Zusätzlich zu der intermolekularen Wechselwirkung der isolierten G-Domäne von hGBP1 konnte mit dem 2-Hybrid-System gezeigt werden, dass es auch eine bisher unbekannte Selbst-Assemblierung der isolierten helikalen Domäne - dem C terminalen Teil des Proteins - gibt. Da es dafür bisher keine Hinweise gab, wurde dieses Ergebnis mit unabhängigen Methoden weiter untersucht. Die Beobachtung konnte mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie, der Dynamischen Lichtstreuung und mit Cross-Link Experimenten verifiziert und quantifiziert werden. Die aus den Helices α7-13 bestehende helikale Domäne wird in zwei Subdomänen unterteilt, die aus den Helices α7-11 bzw. α12-13 bestehen. Die Analyse der Subdomänen mit den genannten Methoden zeigt eindeutig, dass die Subdomäne α12-13 für die Selbst-Assemblierung verantwortlich ist. Für die Subdomäne α7-11 war keine eindeutige Interaktion nachweisbar. Mit Hilfe der CD-Spektroskopie und der Differential Scanning Kalorimetrie wurde die thermische Stabilität des Wildtyp-Proteins und der isolierten Domänen untersucht. Ebenso unterscheiden sich die Schmelztemperaturen der beiden Subdomänen α7-11 und α12-13 um 12°. Die beiden Subdomänen stabilisieren sich gegenseitig. Die gemessene Schmelztemperatur des Wildtypsprotein und der helikalen Domäne α7-13 sind nahezu gleich. Im Vergleich mit dem Wildtypprotein hat die G-Domäne eine um 13° niedrigere Schmelztemperatur. Möglicherweise wird die G-Domäne durch die helikale Domäne stabilisiert. Im Unterschied zu der G-Domäne verläuft die Entfaltung der helikalen Domänen reversibel, so dass eine genauere thermodynamische Analyse möglich ist. So konnte mit der Differential Scanning Kalorimetrie auch die Selbst-Assemblierung der Subdomäne α12-13 erforscht werden. Die Auswertung der Daten zeigt, dass sich die Subdomäne α12 13 eher zu Dimeren als zu Trimeren oder Tetrameren anordnet. Dieser Nachweis ist mit der der G-Domäne von hGBP1 nicht möglich, da es dabei zu einer irreversiblen Entfaltung und der Präzipitation des Proteins kommt. Mit Hilfe der Isothermen Titrationskalorimetrie wurden die Dissoziationskonstanten (KD) der isolierten helikalen Domänen gemessen. Der KD beträgt 100 µM für das Dimer der isolierten helikalen Domäne α7-13 und 4,7 µM für das Dimer der Subdomäne α12-13. Diese relativ schwache Assoziation der helikalen Domänen reicht nicht aus, damit das Wildtyp-Protein im nukleotidfreien Zustand dimerisiert. Außerdem deuten diese Ergebnisse auf einer Strukturänderung hin, zu der es beim Wildtyp-Protein im Nukleotid gebundenem Zustand kommt, damit der Beitrag der Subdomäne α12-13 so stark sein kann, wie es für die isolierte Domäne beobachtet wird. Das Wildtyp-Protein von hGBP1 bildet im nukleotidgebundenen Zustand nicht nur Dimere sondern auch Tetramere. Im Unterschied zum Wildtyp-Protein bildet die isolierte G-Domäne vorwiegend Dimere. Die nachweisbare Tetramerisierung des Wildtyp-Proteins zeigt, dass neben der G-Domäne auch die helikalen Domänen interagieren. Diese sind verantwortlich für die Selbst-Assemblierung des Wildtyp-Proteins zu höherwertigen Strukturen. Interessante Schlussfolgerungen konnten auch aus den Experimenten mit Punktmutanten gewonnen werden. Diese ermöglichen es, die Nukleotidbindung und/oder Hydrolyse zu beeinträchtigen und den Effekt zu studieren. Ferner kann die Farnesylierung durch eine Punktmutation unterdrückt werden und es zeigte sich, dass die Farnesylgruppe die Selbst-Assemblierung verstärkt. Diese Arbeit zeigt, dass die biochemische und biophysikalische Analyse von Proteinen wichtige Informationen beiträgt, um die aus der Röntgenstrukturanalyse gewonnen Strukturinformationen zu vervollständigen. Diese Informationen können aus Röntgenstrukturanalysen nicht gewonnen werden, da diese nur ein statisches Bild liefern. Die helikale Domäne von hGBP1 - speziell die Subdomäne α12-13 - liefert einen Beitrag zur Selbst-Assemblierung des Proteins. Wie weit dieser durch Nukleotidbindung und eine darauf folgende Strukturänderung der G-Domäne kontrolliert wird und inwieweit dieser zur biologischen Funktion von hGBP1 beiträgt, muss in weiteren Experimenten geklärt werden. The aim of this thesis was the biochemical and biophysical characterisation of the self-association of the human Guanylate-Binding Protein 1 (hGBP1). In particular, the contribution of distinct amino acid side chains and the role of the G domain as well as the helical domain were analyzed. In a previous study the crystal structure of full-length human GBP1 was determined. In the presence of the GTP analogue GppNHp the protein crystallized with one molecule in the asymmetric unit. Based on crystal contacts the authors identified two tentative models for a homodimer which served as a working hypothesis in this work. It could be demonstrated with the yeast 2-hybrid system that there is no interaction between the G-domain and the helical domain in contradiction to one of the models. However, the interaction between the G-domains as anticipated in the other model, could be substantiated with the 2-hybrid-system and by several biochemical methods like the analytic size exclusion chromatography and covalent linkage with chemical cross-linker agents. In addition to the intermolecular interaction of the isolated G-domains of hGBP1 it could be shown with the 2 hybrid-system that there is also a hitherto unknown self-association of the isolated helical domain, i.e. the C-terminal half of the protein. In order to further explore this finding, this issue was further examined with independent methods. Size exclusion chromatography, dynamic light scattering and cross-link experiments could verify and quantify the initial observation. The helical domain of hGBP1 consisting of α 7-13 is divided into two subdomains the first of which consists of the helices α 7-11 and the second of the α12-13. The analysis of the subdomains with the methods mentioned shows clearly that the subdomain α12-13 is responsible for the self assembly whereas for the subdomain α7-11 no strong interaction was observed. With help of CD spectroscopy and Differential Scanning Calorimetry the thermal stability of the full-length protein and the isolated domains was examined. The observed melting temperatures of the full-length protein and the helical domain (α7 13) are similar to each other. In contrast to the full-length protein is the melting temperature of the G-domain 13 degree lower. It may be concluded that the helical domain stabilize the G-domain. Also the melting temperature of the two subdomains α7-11 and α12-13 shows a different of 12 degree. The two subdomains exert stabilizing effects on each other. In contrast to the G-domain the helical domains unfolded reversibly, so that they are accessible to a more exact thermodynamic analysis. For the subdomain α12-13 Differential Scanning Calorimetry could be used to investigate also the self-association of this moiety. The analysis of these data showed that dimerisation of subdomain α12-13 takes place rather than formation of trimers or tetramers. Unfortunately, irreversible unfolding and precipitation does not allow this type of analysis for the G-domain of hGBP1. The dissociation constants (KD) of the helical domains were measured by means of Isothermal Titration Calorimetry. The KD of the isolated helical domain α7-13 dimer was determined with 100 µM and of the subdomain α12-13 with 4.7 µM. This relatively weak association of the helical domains seems not to be sufficient for the interaction of the full-length protein under nucleotide-free conditions. In addition, these results may indicate a structural change of the full-length protein in the nucleotide-bound state, so that the subdomain α12 13 can contribute as strongly as it is observed here for the isolated domain. The full-length hGBP1 forms dimers and tetramers in the nucleotide-bound state. In contrast to the full-length protein the isolated G-domain forms predominantly dimers. The provable tetramers of the full-length protein show that additionally to the G domain also the helical domains interact in the full-length protein and they are responsible for higher order self-assembly of hGBP1. Interesting conclusions could be won also from the experiments with point mutations which allow to impair nucleotide binding and/or hydrolysis and study the effects. Also farnelysation can be suppressed by a point mutation and it was found that the farnesyl group strengthens the self-assembly. This thesis demonstrates that the biochemical and biophysical analysis of proteins contribute important data in order to complete the structural informations obtained by X-ray analysis which only supplies a static view of the protein. The helical domain of hGBP1, and more specifically the subdomain α7-13, plays a role in the self assembly of the protein. How much this is controlled by nucleotide-binding and subsequent structural changes of the G-domain and in how far this is related to the biological function of hGBP1, must be addressed in further experiments.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	05.02.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	01.02.2006
Datum der Promotion:	01.02.2006