Dokument: Neue Ansätze zur Analyse von Kraftspektroskopiedaten und Aufdeckung von Energielandschaften

Titel:	Neue Ansätze zur Analyse von Kraftspektroskopiedaten und Aufdeckung von Energielandschaften
Weiterer Titel:	New approaches for the analysis of force spectroscopy data and uncovering of free energy landscapes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33176
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150122-102439-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bieker, Adeline [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 24,53 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.01.2015 / geändert 19.01.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Oesterhelt, Filipp [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	single molecule force spectroscopy, energy landscape, atomic force microscope
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Zelle ist das strukturelle Bauelement von Leben. Um die Stoffwechselprozesse und damit verbundene Krankheiten verstehen zu können, ist es wichtig, die inter- und intramolekularen Wechselwirkungen zu verstehen. Dies trägt zur Entwicklung von Medikamenten bei, die an spezifische Ziele wie zum Beispiel ein Protein angreifen, um ungewollte Wechselwirkungen zu vermeiden, die zu Nebenwirkungen führen. Die Einzelmolekülkraftspektroskopie ist eine weitverbreitete Methode, inter- und intramolekulare Wechselwirkungen zu untersuchen. Dabei wird die Dissoziation der molekularen Wechselwirkung abhängig von einer externen Kraft beobachtet. Diese induzierte Dissoziation kann als thermisch aktivierter Zerfall über eine Potentialbarriere der Energielandschaft, die die molekulare Wechselwirkung beschreibt, beschrieben werden, aber die Bestimmung und Interpretation der Parameter, die die Energielandschaft beschreiben, ist immer noch eine Herausforderung. Ich entwickle ein Modell, um durch einen Fit an die kraftabhängige Dissoziationsrate die Potentialbreite Dx0, die Barrierenhöhe DG0 und die sogenannte "attempt frequency" v0 zu bestimmen. Dafür berücksichtige ich eine verallgemeinerte Abhängigkeit der Energielandschaft von der Wechselwirkungskoordinate, charakterisiert durch die Potenz n. Durch die Untersuchung des Modells mit simulierten Daten zeige ich eine lineare Abhängigkeit von Dx0 von der Fitpotenz auf. Gleichermaßen weisen DG0 und v0 eine starke Abhängigkeit von der Fitpotenz auf. Dies führt zu einer Unter- oder Überschätzung der Parameter, wenn die falsche Fitpotenz gewählt wird. Die Anwendung der Analysestrategie auf experimentelle Daten in Verbindung mit einer besseren Freely Jointed Chain-Fitroutine deckt eine bemerkenswert verkürzte Lebensdauer des R176A-DNA-Komplexes im Vergleich zur Bindung des Wildtyps an DNA auf. Nach einer weiterführenden Analyse, ist diese Beobachtung als unspezifische Wechselwirkung der DNA mit Gold interpretiert, während die Bindung der Mutante an die DNA komplett unterbrochen zu sein scheint. Das Rastersondenmikroskop ist eine der wenigen Methoden, die die Untersuchung der Entfaltung eines einzelnen Membranproteins erlaubt. Im zweiten Teil dieser Arbeit haben wir diese Methode das erste Mal verwendet, um den konzentrationsabhängigen Einfluss von kompatiblen Soluten auf die Entfaltung von Bacteriorhodopsin zu untersuchen. Die Analyse der einzelnen Entfaltungsschritte erlaubt einen Einblick in die Wechselwirkung der Osmolyte mit den verschiedenen Strukturelementen des Proteins. Die Dissoziationskraft zeigt für jeden Entfaltungsschritt und jede Osmolytkonzentration dasselbe Muster. Wir konnten keine signifikante Entstehung von Zwischenschritten in der Entfaltung beobachten. Das führt uns zu der Annahme, dass die Osmolyte nicht spezifisch an das Membranprotein binden. Außerdem konnten wir eine leichte Zunahme der Dissoziationskraft mit steigender Osmolytkonzentration beobachten, was auf den Stabilisierungseffekts von Osmolyten hinweist. Die Persistenzlänge zeigt eine mögliche Reduzierung mit steigender Osmolytkonzentration. Dies weist auf eine steigende Tendenz des Proteins hin, sich außerhalb der Membran mehr zu winden, was die Rückfaltung des Proteins in die Membran unterstützt. Diese Ergebnisse versprechen ein verbessertes Verständnis von inter- und intramolekularen Wechslewirkungen, das zu einem eventuellen Fortschritt in der Entwicklung von spezifischen Medikamenten beitragen wird. The cell is the structural unit of life. For understanding the metabolic processes and related diseases, it is important to understand inter- and intramolecular interactions. This will lead to a development of drugs against specific targets like proteins to prevent unwanted interactions causing side effect. Single-molecule force spectroscopy is a common technique to investigate inter- and intramolecular interactions. Specifically, it can be used to observe the dissociation of the molecular bond in dependence on the external force. This forced dissociation process can be viewed as a thermally activated escape over a potential barrier of the energy landscape describing the molecular interaction, but the determination and interpretation of parameters describing the energy landscape obtained from force spectroscopy data is challenging. I develop a model to fit the force-dependent dissociation rate to determine the potential width Dx0, the barrier height DG0 and the attempt frequency v0. To that aim I consider a generalized dependence of the energy landscape on the interaction coordinate, characterized by the order n. By testing the model with simulated data, I reveal a linear dependency of Dx0 on the fit order; similarly, DG0 and v0 show a strong dependence. This leads to an under- or overestimation of these parameters if the wrong fit order is chosen. The application of this analysis strategy combined with an improved freely jointed chain fit to experimental data reveals a remarkably short lifetime of the R176A-DNAcomplex compared to the binding of the wildtype to DNA. Upon further analysis, this is interpreted as an unspecific binding of the DNA to gold, therefore the binding of the mutant to the DNA seems to be completely disrupted. The atomic force microscope is one of the few methods allowing to investigate the unfolding of a single membrane protein. In the second part of this work we use this technique for the first time to analyse the concentration-dependent influence of compatible solutes on the unfolding of Bacteriorhodopsin. By the analysis of each unfolding step the effect of osmolytes on the different structural parts gives an insight on the interaction of the osmolytes with the protein. The dissociation forces show for each osmolyte-concentration and unfolding step the same pattern. We do not observe significantly additional intermediate unfolding steps, which we interprete as the absence of specific binding to the protein. Furthermore a slight increase in force with increasing concentration of osmolytes is observed indicating the stabilising effect of osmolytes. The persistence length shows a possible slight decrease with ncreasing concentration of osmolytes. This indicates an increased tendency of the protein to coil up outside the membrane which supports the refolding of the protein. These results hold the promise of improved understanding of inter- and intramolecular interactions yielding eventually advances in the development of specific drugs.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	22.01.2015
Dateien geändert am:	22.01.2015
Promotionsantrag am:	19.11.2014
Datum der Promotion:	17.12.2014