Dokument: Strukturelle Untersuchung der Interaktion zwischen HCV NS5A und Bin1

Titel:	Strukturelle Untersuchung der Interaktion zwischen HCV NS5A und Bin1
Weiterer Titel:	Structural analysis of the interaction of HCV NS5A and Bin1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33128
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150113-111534-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Winzösch, Christina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,34 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.01.2015 / geändert 12.01.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter]
Stichwörter:	Hepatitis C Virus, NS5A, Bin1 SH3
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In den letzten Jahren wurden erhebliche Fortschritte bei der Behandlung von Hepatitis C-Virus-Infektionen gemacht, jedoch bleibt die herausragende Rolle des Nicht-Strukturproteins 5A, NS5A, in der viralen Replikation und Partikelassemblierung weitestgehend unbekannt. NS5A des Genotyps 1 enthält in einer polyprolinreichen Region drei PxxP-Motive, eins der Klasse I und zwei der invers-orientierten Klasse II. Src-Homologie 3, SH3, -Domänen binden an diese PxxP-Motive. Eine besonders hohe Affinität wurde für das „bridging-integrator-protein 1“, Bin1, mit seiner SH3-Domäne bestimmt. Dieses Protein kommt in vivo als Dimer mit membrankrümmenden Eigenschaften vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von Bin1 SH3 und Bin1 Tandem-SH3, das den dimerisierten Zustand in vivo mit zwei sequenzgleichen SH3-Domänen und einem Linker imitiert, mit verschiedenen Konstrukten von NS5A biophysikalisch untersucht. Zur biophysikalischen Charakterisierung wurden die fünf Proteine heterolog exprimiert und gereinigt, während zwei Peptide bestellt wurden. Mit SPR- und BLI-Experimenten wurde die mit 10 nM sehr viel höhere Affinität des Bin1 Tandem-SH3 im Vergleich mit Bin1 SH3 zu einem NS5A-Konstrukt, das alle drei PxxP-Motive enthält, festgestellt. Dabei band bei niedrigen Konzentrationen eine SH3-Domäne an das hochaffine PxxP-Motiv, anschließend unter Konformationsänderung erfolgte bei hohen lokalen Konzentrationen die Assoziation der anderen, äquivalenten SH3-Domäne des Bin1 Tandem-SH3 an den Liganden. Einen Vorteil bietet die Multivalenz des Bin1 Tandem-SH3 zur Generierung der optimalen Membranumgebung, zu einer Rekrutierung des Replikationskomplexes zu diesen Membranen und zur Assemblierung der Virionen. Mit ITC-Messungen wurden verschiedene NS5A-Konstrukte verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass Bin1 Tandem-SH3:NS5A einen 1:1-Komplex bildeten, der besonders affin war, wenn PxxP-Motive der Klasse II gebunden hatten. Diese beiden PxxP-Motive PP2.1 und PP2.2 unterschiedlicher Affinität werden in der Replikation und der Assemblierung benötigt. Mit NMR-Titrationen wurden kanonische und nicht-kanonische Bindestellen des NS5A und die Vorteile der multivalenten Eigenschaften Bin1 Tandem-SH3 hinsichtlich der HCV Variabilität bestätigt. Mittels Röntgenstrukturanalyse und NMR-Spektroskopie sollte der energetisch-favorisierteste Komplex Bin1 Tandem-SH3:NS5A(341-361), ein Konstrukt mit allen drei PxxP-Motiven, strukturell aufgeklärt werden. Dabei kristallisierte Bin1 Tandem-SH3 indem beide Bindestellen über hydrophobe Wechselwirkungen selbstinteragierenten. Die Zuordnung der Resonanzsignale mit NMR erfolgte für die apo- und holo-Zustände vollständig, und eine Strukturrechnung der beiden frei und gebundenen Bin1 Tandem-SH3-Zustände war erfolgreich. Ebenso erfolgte die Zuordnung des Liganden. Jedoch war die Anzahl der intermolekularen NOEs zwischen Bin1 Tandem-SH3 und NS5A(341-361) nicht ausreichend für eine Komplexstrukturbestimmung. Es bestätigte sich jedoch, dass die beiden PxxP-Motive der Klasse II von den beiden separat-agierenden SH3-Domänen in einem multivalenten Komplex gebunden wurden, jedoch ein dynamischer Komplex entstand, bei dem der Ligand über die Bindestelle gleitete. In recent years, progress in the treatment of Hepatitis C virus, HCV, infections led to a greater understanding in viral life cycle. Eventhough the remarkable role of the non-structural protein 5A, NS5A, in viral replication and particle assembly remains poorly understood. NS5A of genotype 1 contains in its polyproline rich region three PxxP-motifs, one of class I and two of the invers oriented class II motifs. Src homology 3, SH3, domains can bind to the PxxP-motifs of NS5A. One of the high affinity interactors is the bridging integrator protein 1, Bin1, a protein with membrane bending properties as a homodimer. In this work, the interaction of Bin1 SH3 and Bin1 Tandem-SH3, mimicking the dimerization status in vivo through two sequencial equivalent SH3 domains separated by a linker, with various constructs of NS5A was studied. For biophysical characterization, five proteins were heterologous expressed and purified, while two peptides were purchased. With SPR and BLI experiments, a low affinity of 10 nM was obtained for Bin1 Tandem-SH3 and a construct of NS5A containing all three PxxP motifs. At low concentrations, one SH3 domain associated with the high affinity PxxP motif. After conformational change, the second equivalent domain of Bin1 Tandem-SH3 bound the ligand at high local concentrations. The multivalency leads to advantages in the generation of optimal membrane conditions to recruit the HCV replication complex to these membranes and to the assembly of virions. ITC measurements compared three different NS5A constructs with both Bin1 proteins. As a result, Bin1 Tandem-SH3 formed 1:1 complexes with highest affinity to both class II PxxP motifs PP2.1 and PP2.2. Those motifs are involved in replication and assembly in genotype 1 and are thus crucial for the viral life cycle. Canonic and non-canonic binding motifs of NS5A were confirmed by NMR titrations under interaction of both binding motifs to Bin1 Tandem-SH3. Consequently, a multivalent complex is advantageous for HCV variability. The complex of Bin1 Tandem-SH3 and NS5A(341-361) containing all three PxxP motifs should be structurally defined by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Bin1 Tandem-SH3 crystallized in such a way that the ligand binding site was occupied by another adjacent SH3 domain. The assignment of resonance signals with NMR was completely obtained for the apo and holo state of Bin1 Tandem-SH3, which led to two successful structure calculations. Likewise, the assignment of the ligand was achieved. Yet, the number of intermolecular NOEs was too low to determine the complex structure. It was confirmed that the interaction took place separately for both SH3 domain to both class II PxxP motifs, yet the dynamic complex allowed the ligand to slide on the SH3 binding site.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	13.01.2015
Dateien geändert am:	13.01.2015
Promotionsantrag am:	10.11.2014
Datum der Promotion:	17.12.2014