Dokument: Epigenetische Biomarker für die Diagnose und Prognose des Harnblasenkarzinoms
| Titel: | Epigenetische Biomarker für die Diagnose und Prognose des Harnblasenkarzinoms | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33080 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20150804-100952-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr.rer.nat. Beermann, Agnes [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Martin, William [Gutachter] PD Dr. rer. nat. Santourlidis, Simeon [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Epigenetische Regulatoren wie die DNA-Methylierung spielen eine wichtige Rolle in der Tumorgenese. Dabei stellen aberrante Methylierungsmuster in Harnblasenkarzinomen eine zentrale Veränderung dar, die die Entwicklung von neuen Diagnostikverfahren und Therapieansätzen ermöglichen können. Daher wurde die Hypothese verfolgt, dass Urin als Untersuchungsmaterial am Geeignetsten zur Entwicklung von nichtinvasiven Diagnostikverfahren ist.
Die Ergebnisse aus dem ersten Teil der Arbeit haben gezeigt, dass DNA aus Urin als Ausgangsmaterial zur Entwicklung von neuen epigenetischen Testverfahren und zum Nachweis der Methylierung in Retrotransposons gut geeignet ist. Darüber hinaus können die Lagerung der Urinproben bei -20°C und die Zugabe von DNA-schützenden Reagezien wie EDTA und Protease, negative Einflüsse (wie DNA-Degradationsprozesse und Einflüsse durch Fremd-DNA) auf die PCR-Effizienz, weitestgehend verhindern. Gleichzeitig konnte nachgewiesen werden, wie essentiell die Optimierung der PCR-Bedingungen (Primer-Konzentration, DNA-Templatemenge) für die Ermittlung der Spezifität sowie Sensitivität ist. Die Annahme, dass freie DNA- die vermehrt von den Tumorzellen freigegeben wird, geeigneter zur Bestimmung des Methylierungsstatus ist als die zelluläre DNA, konnte nicht bestätigt werden. Beide DNA-Fraktionen wiesen eine gleich starke Sensitivität (ca. 90%) und gleichzeitig geringe Spezifität (ca. 37%) auf. Es ist gelungen eine Korrelation zwischen dem autonomen LINE-1 und dem nicht-autonom replizierenden Alu Element nachzuweisen, wobei angenommen wird, dass sich die Alu Elemente der „trans-acting“ Faktoren der LINEs bedienen. Methylierungsuntersuchungen des LINE-1 Promotors, die mit Hilfe von Bisulfit-Sequenzierungsanalysen zellulärer und freie Urin-DNA von Blasenkarzinompatienten durchgeführt wurden, sowie der Nachweis der LINE-1 Transkription, haben weitere Evidenzen für die Aktivität des LINE-1 Retrotransposons im Harnblasenkarzinom geliefert. Dabei konnte beobachtet werden, dass bestimmte CpG-Positionen bevorzugt demethyliert werden und dass es sich hier um eine vollständiges „full-length“ LINE-1 Element handelt, das zur Transposition fähig sein kann. Gleichzeitig ist es gelungen einen neu kreierten Parameter, bestehend aus dem Quotienten LINE-1-Methylierung-/LINE-1-Transkription zu ermitteln, der für die Entwicklung neuer nichtinvasiver Testverfahren zur Diagnose, Prognose und ggf. einem Monitoring dienlich sein könnte. Zusätzliche Promotoranalysen mittels der MIRECAL-Methode, die die direkte und quantitative Analyse der Chromatinzugänglichkeit des LINE-1 Promotors nachweisen sollten, konnten nur in vereinzelten zellulären Urinproben von Patienten gezeigt werden. Die Methode erwies sich für die Urinproben als ungeeignet, auf Grund einer geringen Reproduzierbarkeit. Southern Blot-Untersuchungen mit deren Hilfe die Telomerenlängen der Urin- und Blut-DNA von Blasenkarzinompatienten bestimmt wurden, führten zu der Annahme, dass zwar die Telomere der Blut- und zellulären Urin-DNA zum Nachweis eingesetzt werden können, jedoch diese Methode zur Bestimmung der Progression von Blasentumoren eher ungeeignet ist. Der zweite Teil der Arbeit, befasst sich mit der Suche nach neuen differentiell methylierten Regionen. Die in dieser Studie gefundenen hyper- als auch hypomethylierten DMRs können als potentielle Biomarker angesehen werden. Mit deren Hilfe kann ein nichtinvasiver Früherkennungstest zur Detektion von Harnblasenkarzinomen entwickelt werden. Es konnten zahlreiche hyper- und hypomethylierte DMRs sowohl erfolgreich im Gewebe als auch in Urin und Blutplasma von Harnblasenkarzinompatienten bestimmt werden. Darüber hinaus konnten mit Hilfe einer Subgruppenanalyse hyper- und hypomethylierte miRNAs sowie ihre Targets ermittelt werden. Ihre Zielgene (z.B. LUC7L3, ACE2 und CHSY1), aber auch sie selbst, könnten als potentielle Biomarker für einen nichtinvasiven Früherkennungstest eingesetzt werden. Ebenfalls könnten sie als neue Angriffspunkte zur Entwicklung von neuen Therapiebehandlungen dienen.Epigenetic regulators such as DNA methylation play an important role in tumorigenesis. Thereby aberrant methylation patterns represent an essential change in bladder cancer, which can be used for the development of new diagnostic procedures and therapeutic approaches. Therefore the hypothesis was pursued, that urine can be most suitable for the development of noninvasive diagnostic procedures.The results from the first part of the dissertation have shown that DNA from voided urine is well suited to develop new epigenetic assays and can be used for the detection of methylation from retrotransposons. Moreover, the storage of the urine samples at -20 ° C and the addition of DNA-protecting reagents such as EDTA and protease, can prevent the PCR efficiency from negative influences (DNA degradation and influences by foreign DNA). At the same time, the importance of the optimized PCR conditions (primer concentration, template DNA amount) for the determination of specificity and sensitivity was demonstrated.The assumption that free DNA-which is increasingly, released from the tumor cells- is suitable for the determination of methylation status, could not be confirmed. Both DNA fractions show an equally strong sensitivity (80%) and low specificity (about 37%) on. However, it was possible to prove a correlation between the autonomous LINE-1 and the non-autonomous Alu element, that it can be assumed that the Alu elements use the “trans-actin” factors of LINE-1. Methylation analysis of the LINE-1 promotor performed by genomic sequencing of bisulfite-converted cellular and cell-free DNA from bladder cancer patients and the proof of the LINE-1 transcription, show evidences for the LINE-1 activitiy.The data revealed that certain CpG positions appear to be more susceptible to demethylation and it seems to be a full-length LINE-1 element that is able for transposition. Concurrent a new parameter was created (quotient LINE-1 methylation/LINE-1 transcription), that could be used for the development of noninvasive diagnostic, prognostic or monitoring procedures. Additionally LINE-1 promoter analysis by MIRECAL, which allow a direct and quantitative analysis of chromatin accessibility, was only possible in few cellular DNA urine samples. Due to the non-reproducibility the method was not suitable in case of urine samples. Both, DNA from blood and cellular DNA from voided urine can be used successefully to determine the length of the telomeres. This was proofed by the southern blot analysis. However, this method is not suitable to determine the progression of bladder cancer. The second part of this dissertation is focused on new differential methylated regions. Those detected hyper- and hypomethylated regions can be considered as new potential biomarkers for the development of noninvasive early diagnosis assay for bladder cancer. Hyper- and hypomethylated DMRs were successfully detected in tissue, blood and urine from bladder cancer patients. Furthermore, hyper- and hypomethylated miRNAs and their targets were also detected in the tissue and body fluids. Their targets (such as LUC7L3, ACE2 and CHSY1), also the miRNAs themselves can be potential biomarkers for noninvasive early diagnosis assay. They can also be used as new approach for the development of new therapy treatments to detect bladder cancer, progression and recurrent. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 04.08.2015 | |||||||
| Dateien geändert am: | 04.08.2015 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.08.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.10.2014 |
