Dokument: Einfluss von Luteolin auf die DNA-Integrität in Kolonkarzinomzellen: Rolle des Arylhydrokarbon Rezeptors

Titel:	Einfluss von Luteolin auf die DNA-Integrität in Kolonkarzinomzellen: Rolle des Arylhydrokarbon Rezeptors
Weiterer Titel:	Influence of luteolin on the DNA integrity in colon carcinoma cells: role of the aryl hydrocarbon receptor
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33004
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20141218-144832-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Stobbe-Maicherski, Natalie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,95 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.12.2014 / geändert 18.12.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Fritsche, Ellen [Gutachter] Prof. Dr. Proksch Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Flavonoid Luteolin gehört zur Gruppe der pflanzlichen Polyphenole, die in vielen Pflanzen als Sekundärmetaboliten gebildet werden. Laut Ergebnissen epidemiologischer Studien korreliert eine erhöhte Aufnahme von Flavonoiden mit einem verminderten Risiko für Darmkrebs. Die Entstehung von Vorstufen des Darmkrebs‘ kann durch orale Aufnahme von indirekten Kanzerogenen wie Benzo(a)pyren (B(a)P) begünstigt werden, welche seine gentoxischen Eigenschaften erst nach einer metabolischen Aktivierung entfalten können. Die Umwandlung des B(a)P zum hochreaktiven Metaboliten wird durch den zentralen Regulator des Fremdstoffmetabolismus Arylhydrokarbonrezeptor (AHR) initiiert. Interessanterweise ist auch Luteolin in der Lage, den AHR-Signalweg zu antagonisieren. Da Luteolin in der Literatur als eine geeignete Substanz zur Chemoprävention verschiedener Krebserkrankungen (u.a. Darmkrebs) vorgeschlagen wird und es außerdem Hinweise auf sein genotoxisches Potential gibt, sollten beide Endpunkte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden. Der postulierte chemopräventive Mechanismus von Luteolin beruht auf Interaktion mit dem AHR Signalweg. Aus diesem Grund wurden zunächst Effekte dieses Flavonoids auf die metabolische B(a)P-Aktivierung im etablierten Darmzellmodell Caco-2 sowie in den Kolonkarzinomzellen HCT116, in denen der AHR-Signalweg mittels shRNA-Technik erfolgreich gehemmt wurde, untersucht. Die Zellen mit dem AHR-knockdown (HCT-shAHR) zeigten im Vergleich zu den Leervektor-Kontrollzellen (HCT-EV) eine signifikant verminderte Expression des AHR und seines Zielgens CYP1A1. Expressionsanalysen der B(a)P-metabolisierenden Gene CYP1A1 und GSTA2 in AHR-profizienten Caco-2 und HCT-EV Zellen zeigten, dass Luteolin die B(a)P-stimulierte Zunahme deren Transkriptmengen dosisabhängig inhibiert. Auch bei der anschließenden Überprüfung der CYP1A1-Aktivität bewirkte die Inkubation der HCT-EV Zellen mit Luteolin eine signifikante Hemmung der B(a)P-induzierten Enzymaktivität. In den HCT-shAHR Zellen wurde erwartungsgemäß keine Änderung in der Expression AHR-abhängiger B(a)P-metabolisierender Gene sowie keine messbare CYP1A1-Enzymaktivität beobachtet. Die Resultate der indirekten Bestimmung der BPDE-DNA-Addukt-Bildung im Comet-Assay weisen darauf hin, dass Luteolin in der Lage ist, die B(a)P-induzierte DNA-Schädigung signifikant abzumildern. Verantwortlich für diesen Effekt ist die in den Genexpressionsanalysen und im EROD-Assay gezeigte AHR-abhängige Hemmung der CYP1A1-Expression und dessen Enzymaktivität. Um die beobachtete Reduktion der B(a)P-induzierten DNA-Schädigung durch Luteolin zu bestätigen, ist eine weitere direkte Messung des B(a)P-DNA-Addukt-Levels notwendig, die jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht etabliert werden konnte. Neben den protektiven Eigenschaften von Luteolin gegenüber der B(a)P-induzierten DNA-Schädigung wurde als nächstes die Beeinflussung der DNA-Integrität durch die Luteolin-Behandlung in Kolonkarzinomzellen untersucht. Initial wurde eine Luteolin-vermittelte Hemmung der Zellproliferation beobachtet. Die in den HCT-EV und HCT-shAHR Zelllinien durchgeführten Zellzyklusanalysen zeigten, dass niedrige Luteolin-Konzentrationen (5-10 µM) in HCT-EV eine signifikant höhere S-Phase-Arretierung als in den HCT-shAHR Zellen bewirken. Die Bestimmung der Teilungsrate der HCT-EV Zellen deutete darauf hin, dass nicht die verstärkte Zellproliferation die Zellzyklusblockade auslöst sondern andere Vorgänge wie Luteolin-induzierte DNA-Schädigung für die Initiierung des S-Phase-Arrests verantwortlich sind. Die Überprüfung des gentoxischen Potentials dieses Flavonoids ergab in HCT-EV Zellen eine höhere dosisabhängige Zunahme der DNA-Doppelstrangbrüche und der intrazellulären γH2AX-Proteinmenge als in HCT-shAHR Zellen. Zudem konnte festgestellt werden, dass die verstärkte Bildung der DNA-Doppelstrangbrüche in diesen Zellen mit der erhöhten Phosphorylierung der JNK1-Kinase sowie mit der signifikant erhöhten intrazellulären Akkumulierung des p53-Proteins korreliert. Darüber hinaus wurde in HCT-EV Zellen eine signifikant höhere Expression des p53-abhängigen CDK2-Inhibitorproteins p21/Cip1 beobachtet, welches für die verstärkte Initiierung der Zellzyklusblockade verantwortlich sein könnte. Die gezeigte Luteolin-vermittelte Induktion der DNA-Doppelstrangbrüchen könnte laut Literatur auf seiner Fähigkeit zur Hemmung der DNA-Topoisomerase-Enzymen I / II beruhen. Die mechanistische Aufklärung der DNA-schädigenden Wirkweise von Luteolin in Abhängigkeit vom aktiven AHR-Signalweg könnte eine neue Perspektive für das chemotherapeutische Potential dieses Naturstoffes liefern. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass Luteolin durch die Interaktion mit dem aktiven AHR-Signalweg chemopräventive Effekte gegenüber der B(a)P-induzierten DNA-Schädigung ausüben kann. Dennoch ist die unkontrollierte Aufnahme von Luteolin als ein präventives Mittel gegen Krebserkrankungen aufgrund der beobachteten AHR-abhängigen genotoxischen Eigenschaften nicht bedenkenlos. The flavonoid luteolin belongs to a group of naturally occurring polyphenolic compounds. Results of epidemiological studies indicate that the increased intake of flavonoids with a plant-rich diet can reduce the incidence of colorectal cancer. The development of colorectal cancer pre-stages can be promoted due to the dietary intake of indirect carcinogens like benzo(a)pyrene (B(a)P), which require a metabolic activation in order to interact with cellular DNA and provoke gene mutations. The transformation of B(a)P to its mutagenic metabolite is initiated by the key regulator of the drug metabolism the aryl hydrocarbon receptor (AHR). Interestingly, several studies have demonstrated the ability of luteolin to antagonize the AHR-pathway. Even though, the results from several studies indicate that luteolin may be a suitable chemopreventive agent against cancer, other studies exhibited potential genotoxic properties of this flavonoid. The present study was performed to investigate and characterize these different effects of luteolin. The postulated chemopreventive mechanism of this flavonoid depends on direct interaction with the AHR. Therefore initially the effects of luteolin on the metabolic activation of B(a)P were examined in an established model for colon cell biology, Caco-2, and in HCT116 colon carcinoma cells. In stable transfected AHR-knockdown HCT116 cells (HCT-shAHR) AHR-signaling was significantly repressed compared to the respective empty vector control cells (HCT-EV). Gene expression analyses of the B(a)P-activating enzymes CYP1A1 and GSTA2 revealed that luteolin can significantly reduce the B(a)P-stimulated expression of these genes in AHR-proficient Caco-2 and HCT-EV cells. Along the same line the subsequent measurement of CYP1A1-activity revealed a significant luteolin-mediated inhibition of B(a)P-induced enzyme activity. The inhibition of CYP1A1 gene expression and specific enzyme activity resulted in a significant mitigation of B(a)P-induced DNA damage as determined by the comet assay, an established method to measure B(a)P-induced DNA-damage. As expected, treatment of HCT-shAHR cells with luteolin showed no effect on the expression of AHR target genes and the CYP1A1-activity. To confirm the demonstrated AHR-dependent effects of luteolin on the metabolic activation of B(a)P in colon cells, a direct determination of DNA-adduct level should be performed in future follow-up studies. Beside the protective properties of luteolin against the B(a)P-induced DNA-damage the present study raised concerns with regard to the influence of luteolin on DNA integrity. Initially, a luteolin-mediated inhibition of cell cycle progression was observed. The results of cell cycle analyses indicated that low doses of luteolin can initiate a significant stronger S-phase arrest in HCT-EV compared to HCT-shAHR cells. This effect was not mediated by an increased rate of proliferation but by the induction of DNA double strand breaks (DNA-DSB). This observation was supported by a higher intracellular γH2AX protein amount in AHR-proficient cells. Furthermore the luteolin-induced DNA-DSB correlated with an increased phosphorylation of the JNK1-kinase as well as with an enhanced accumulation of p53 in these cells. Also, the gene expression of the p53-dependent endogenous CDK inhibitor protein p21/Cip1 was significantly increased in HCT-EV, which might be responsible for the enhanced initiation of the S-phase arrest in comparison to HCT-shAHR cells. In accordance with literature the demonstrated induction of DNA double strand breaks by luteolin could be due to its ability to inhibit the enzyme DNA topoisomerase I / II. The clarification of the mechanism of luteolin-mediated genotoxic effects depending on interaction with the AHR-pathway may give a new perspective for a chemotherapeutical potential of this flavonoid. In summary the results of the present work indicate, that the flavonoid luteolin exhibits chemopreventive properties against B(a)P-induced DNA-damage. However, the AHR-dependent genotoxic properties of luteolin observed in this study, raised doubts regarding its uncontrolled usage as a cancer preventive in humans.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	18.12.2014
Dateien geändert am:	18.12.2014
Promotionsantrag am:	07.08.2014
Datum der Promotion:	18.11.2014