Dokument: Vergleichende Analyse der Sec- und Tat-abhängigen sekretorischen Proteingewinnung mit Gram-positiven Bakterien als Wirtsorganismen

Titel:	Vergleichende Analyse der Sec- und Tat-abhängigen sekretorischen Proteingewinnung mit Gram-positiven Bakterien als Wirtsorganismen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3284
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20060109-001284-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Meißner, Daniel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,44 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Freudl, R. [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Stichwörter:	Proteinsekretion, Gram-positive Bakterien, Tat-Weg, Tat-abhängig, Zellwand, Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus carnosus, Bacillus subtilis, Spezies-Spezifitätprotein secretion, gram-positive bacteria, twin-arginine, tat-pathway, tat-dependent, cell wall, species specificity
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Für die sekretorische Proteingewinnung in Gram-positiven Bakterien wurde bislang ausschließlich der Sec-Weg genutzt. Hierbei verläuft die Sekretion heterologer Substrate in vielen Fällen ineffizient, da diese nach der Membranpassage oft nur sehr langsam oder falsch falten und so Opfer extrazellulärer Proteasen werden. Im Tat-Weg erfolgt die Faltung der Substrate bereits im Cytoplasma, wodurch Faltungsprobleme von heterologen Substraten nach der Translokation vermieden werden. Somit ist der Tat-Weg, bei dem die Untersuchungen zu seinem biotechnologischen Potential gerade erst begonnen haben, möglicherweise eine Alternative zum Sec-Weg in der sekretorischen Gewinnung heterologer Proteine. Dieses wurde in der vorliegenden Arbeit anhand der Gram-positiven Bakterien Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum und Bacillus subtilis näher untersucht, wobei zu Beginn nur bekannt war, daß B. subtilis ein funktionelles Tat-System besitzt. Für S. carnosus und C. glutamicum wurde dies hier zum ersten Mal gezeigt. Bei der Charakterisierung der Tat-Systeme zeigte sich, daß unter den hier getesteten Bedingungen der Tat-Weg in C. glutamicum, im deutlichen Gegensatz zur Situation in S. carnosus, eine wichtige Rolle sowohl für das Wachstum als auch für den Stoffwechsel spielt. Zur vergleichenden Bewertung der Sekretionseigenschaften dieser Bakterien wurde die Tat-abhängige Sekretion von verschiedenen Fusionsproteinen untersucht. In S. carnosus stellte sich heraus, daß die Modellproteine CGTase und GFP in der Zellwand stecken bleiben und nicht sekretiert werden. Wobei im Fall der CGTase anscheinend das hohe Molekulargewicht von 70kDa die Zellwandpassage limitiert und beim GFP (25kDa) nicht die Größe, sondern offensichtlich elektrostatische Wechselwirkungen zwischen GFP und der Zellwand die Sekretion verhindern. In C. glutamicum und B. subtilis konnte dagegen gezeigt werden, daß GFP und auch ein weiteres Substrat (MalE) Tat-abhängig mit hoher Ausbeute sekretiert werden. Eine Lokalisierung der Proteine ergab, daß hier nur eine geringe Menge in der Zellwand steckenbleibt und somit die Wechselwirkungen zwischen GFP bzw. MalE und der Zellwand von B. subtilis und C. glutamicum offensichtlich nicht so stark sind wie die im Falle von GFP in S. carnosus. Darüber hinaus zeigte ein Vergleich von Tat- und Sec-abhängiger Sekretion von MalE in C. glutamicum, daß eine deutlich höhere Ausbeute über den Tat-Weg erzielt wird. Dies ist anscheinend eine Folge der höheren Stabilität des über den Tat-Weg exportierten MalE-Proteins. Weiterhin konnte mit der Beobachtung, daß GFP in C. glutamicum in aktiver Form Tat-abhängig sekretiert wird, deutlich gemacht werden, daß der Tat-Weg möglicherweise vor allem für solche Proteine als Sekretionsweg genutzt werden kann, die wie GFP cytosolische Faltungsfaktoren benötigen und daher nicht über den Sec-Weg in aktiver Form sekretiert werden können. Eine Tat-abhängige Sekretion von GFP in B. subtilis und in C. glutamicum konnte sowohl mit heterologen, als auch mit homologen Tat-Signalpeptiden vermittelt werden. Hierbei wurden jedoch je nach verwendetem Fusionsprotein unterschiedliche Ausbeuten erzielt, wobei hierfür offensichtlich die Stabilität der jeweiligen mRNA und/oder des Fusionsproteins entscheidend ist. Darüber hinaus konnte in C. glutamicum gezeigt werden, daß auch das verwendete Medium einen großen Einfluß auf die Ausbeute hat, wobei auch hier vermutet wird, daß die Stabilität der mRNA und/oder des Fusionsproteins, die je nach Medium variiert, dafür verantwortlich ist. Die erhaltenen Befunde machen deutlich, daß es kein generelles System für die heterologe Proteinsekretion gibt, sondern daß für jedes zu sekretierende Protein zuerst nach dem „tool-box“-Prinzip überprüft werden muß, in welcher Fusion, in welchem Wirt und unter welchen Bedingungen, die höchsten Ausbeuten erzielt werden. Tat-Signalpeptide können im Gegensatz zu Sec-Signalpeptiden nicht generell ausgetauscht werden. So wurde auch in dieser Arbeit beobachtet, daß die Tat-Signalpeptide von PhoD aus B. subtilis und C. glutamicum offensichtlich keinen Export von GFP in E. coli und S. carnosus vermitteln, was auf Spezies-spezifische Unterschiede in der Signalpeptiderkennung durch die jeweiligen Tat-Translokasen hindeutet. Dies ist beim TorA-Signalpeptid aus E. coli nicht der Fall, da es bei allen hier untersuchten Organismen einen Tat-abhängigen Export vermitteln kann. Offensichtlich weisen die PhoD-Signalpeptide Eigenschaften auf, die eine Erkennung durch die Tat-Translokasen in E. coli und S. carnosus verhindern.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	09.01.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	12.12.2005
Datum der Promotion:	12.12.2005