Dokument: Optimizing the expression of antibody formats in protease-deficient Ustilago maydis strains

Titel:	Optimizing the expression of antibody formats in protease-deficient Ustilago maydis strains
Weiterer Titel:	Optimierung der Expression von Antikörperformate in Protease-defizienten Aus Ustilago maydis Stämme
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=32766
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20141125-110510-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Sarkari, Parveen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,54 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.11.2014 / geändert 25.11.2014
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The global market for protein biopharmaceuticals is increasing at a tremendous rate. In order to provide the full repertoire of biopharmaceutical proteins, an alternative expression platform based on unconventional secretion of the endochitinase Cts1 was developed in Ustilago maydis. Although U. maydis displays several features that indicate a great potential for its utilization in biotechnology, some shortcomings are needed to be solved. During initial expression studies using an α-myc scFv as a proof-of-principle, one such major limitation observed was low yields of secreted full-length protein. This was mainly due to the proteolytic degradation by host proteases. Hence, the main goal in this study was to tackle this proteolysis problem by elimination of harmful proteases. Initially, the key protease Kex2 known to activate several secreted proteases was targeted. Deletion of the kex2 gene in expression strains led to reduced heterologous protein degradation. However, this deletion mutant also exhibited a peculiar phenotype and lowered growth rates, which can lead to problems in bioreactor studies. Hence, in the next step homologs of some crucial proteases know to be responsible for proteolysis in other fungi were targeted. However, the resulting single deletion mutants did not show any significant improvement in the stability or yields of secreted proteins. Therefore, the most promising approach to tackle the protease problem was to generate a multiple-protease deficient expression strain. An elegant technique of Golden Gate cloning coupled with FLP-FRT marker recycling system was thus employed to generate a quintuple protease deletion strain. This engineered strain displayed much reduced proteolytic activity. Coupled with a strong promoter and an optimized expression cassette, this multiple-protease deficient strain led to much improved stability and enhanced yields of the active secreted scFv-Cts1 fusion protein. To prove the versatility of this expression host, different other antibody formats were attempted to produce. Besides the α-myc scFv, successful production of an active α-Gfp nanobody was shown while expression of a diabody against the myc epitope could not be achieved. Nevertheless, in this study, the U. maydis expression system was optimized significantly in terms of reducing its proteolytic potential. Various antibody formats could thus be produced in this simple eukaryotic organism. With this optimized strain the system is now on a promising way to be exploited for different biotechnological applications. Der globale Markt für Biopharmazeutika steigt immens. Um die volle Bandbreite biopharmazeutischer Proteine herstellen zu können, wurde in Ustilago maydis eine alternative Expressionsplattform basierend auf der unkonventionellen Sekretion der Endochitinase Cts1 etabliert. Auch wenn U. maydis diverse Eigenschaften mit sich bringt, die ein großes biotechnologisches Potential versprechen, müssen jedoch zunächst einige Defizite behoben werden. In initialen Expressionsstudien mit einem α-myc scFv Antikörperfragment stellte sich heraus, dass nur geringe Mengen Volllängen-Protein sekretiert wurden. Dies konnte hauptsächlich auf einen proteolytischen Abbau durch Wirtsproteasen zurückgeführt werden. Daher war das Hauptziel dieser Arbeit, das Degradierungsproblem durch die Eliminierung von Proteasen zu beheben. Zunächst fokussierten die Untersuchungen auf der Schlüsselprotease Kex2, die als Aktivator zahlreicher sekretierter Proteasen bekannt ist. Die Deletion des entsprechenden Gens führte zu einem stark reduzierten proteolytischen Abbau. Zudem zeigte die Mutante jedoch einen auffälligen Phänotyp sowie verlangsamtes Wachstum, was in Bioreaktorstudien zu Problemen führen könnte. Daher wurden in einem nächsten Schritt U. maydis Homologe bekannter schädlicher Proteasen aus filamentösen Pilzen entfernt. Die entsprechenden Einzelmutanten zeigten jedoch keine signifikant verbesserte Stabilität oder höhere Ausbeuten der sekretierten Proteine. Daher war der vielversprechendste Ansatz, einen Stamm mit multiplen Proteasedefizienzen herzustellen. Die Herstellung eines entsprechenden Fünffach-Deletionsstammes wurde mit einer eleganten Golden Gate Klonierungsmethode in Kombination mit einem FLP-FRT Marker-Recyclingsystem bewerkstelligt. Dieser gentechnisch veränderte Stamm zeigte eine stark verringerte proteolytische Aktivität. Im Zusammenspiel mit einem starken Promotor und einer optimierten Expressionskassette konnten so eine deutlich höhere Stabilität und größere Ausbeuten aktiven sekretierten scFv-Cts1 Fusionsproteins erzielt werden. Um die Flexibilität des Expressionswirts zu zeigen, sollten zudem weitere alternative Antikörperformate hergestellt werden. So konnte neben dem α-myc scFv ein aktiver α-Gfp Nanobody hergestellt werden. Dahingegen war die Herstellung eines gegen das myc-Epitop gerichteten aktiven Diabodys nicht möglich. Zusammenfassend konnte jedoch in dieser Arbeit das U. maydis Expressionssystem besonders in Bezug auf die proteolyische Aktivität stark optimiert werden. Verschiedene Antikörperformate konnten erfolgreich in diesem einfachen Eukaroyoten produziert werden. Mit dem hier optimierten Stamm zeigt das Expressionssystem somit großes Potential für diverse biotechnologische Anwendungen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	25.11.2014
Dateien geändert am:	25.11.2014
Datum der Promotion:	21.11.2014