Dokument: Untersuchungen zum peroxisomalen Import von Isocitrat-Lyasen in Saccharomyces cerevisiae

Titel:	Untersuchungen zum peroxisomalen Import von Isocitrat-Lyasen in Saccharomyces cerevisiae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3262
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20051209-001262-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Meyer zu Berstenhorst, Sonja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Stahmann, Klaus-Peter [Gutachter] Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter] Prof. Dr. Hollenberg, Cornelis P. [Gutachter]
Stichwörter:	peroxisomaler Import, PTS1, unkonventionelles PTS, Isocitrat-Lyase, ICL, Glyoxylatweg, Saccharomyces cerevisiae, Fungiperoxisomal import, PTS1, non-canonical PTS, isocitrate lyase, ICL, glyoxylate pathway, Saccharomyces cerevisiae, fungi
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Peroxisomen sind von zentraler Bedeutung für den Fettstoffwechsel sowie zur Entgiftung der bei Oxidationsprozessen entstehenden reaktiven Sauerstoffspezies, z.B. H2O2. Peroxisomale Funktionsstörungen verursachen Krankheiten, oft durch einen Importdefekt bestimmter Enzyme. Die beiden wichtigsten Importwege peroxisomaler Matrixproteine beruhen auf konservierten Signalsequenzen. Das häufigste Signal ist das sogenannte PTS1, ein Tripeptid am Ende des C-Terminus. Seltener kommt ein N-terminales Nonapeptid (PTS2) vor. Darüber hinaus enthalten einige Proteine ein zusätzliches Signal und/oder nutzen einen bisher unbekannten Importweg. Beispielsweise besitzen nur einige peroxisomale Isocitrat-Lyasen ein PTS1-Signal. Die Isocitrat-Lyase (ICL) ist als Schlüsselenzym des Glyoxylatwegs essentiell zum Wachstum auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen. Eukaryotische ICLs sind normalerweise in den Peroxisomen lokalisiert mit Ausnahme der cytosolischen ICL der Bäckerhefe S.cerevisiae. Im Gegensatz zur cytosolischen ScICL enthält die peroxisomale Ashbya gossypii -ICL ein PTS1-Signal. Daher war es interessant zu untersuchen, ob dieses Signal zur Vermittlung des peroxisomalen ICL-Imports ausreichte oder ob ein zusätzliches Signal notwendig war. Durch die Fusion des PTS1-Tripeptids AKL oder den Austausch des C-Terminus gegen den der AgICL wurde ein Import von 3 - 4% der modifizierten ScICL erreicht. Dabei wurde die peroxisomale Lokalisation unabhängig durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation sowie Immuno-Elektronenmikroskopie gezeigt. Auffällig war der mit ca. 20% deutlich effizientere Import von heterolog exprimierter AgICL. Dieser Unterschied wies auf ein zusätzliches peroxisomales Signal der AgICL hin, das der ScICL fehlt. Diese These wurde unterstützt durch Muteine ohne funktionales PTS1, die zu 20% (Ag ICL verlängert um 39 Aminosäuren) bzw. 9% (PTS1 deletiert) importiert wurden. Das für diesen Import nötige Signal wurde im Bereich der Strukturdomäne II der AgICL vermutet und anhand eines Hybridproteins der E.coli -ICL untersucht. Die ICL-Strukturdomäne II ist ein interner Bereich von etwa 100 Aminosäuren, der bei Prokaryoten fehlt. Deshalb wurde durch die Insertion der Ag ICL Strukturdomäne II (Ag DII) das Hybridprotein EcICLAgDII erzeugt. Differentielle Zentrifugationen zeigten eine signifikant peroxisomale Lokalisation dieses Hybrids. Während nach Aktivitätstests nur 0,7% der Wildtyp EcICL in den Hefe-Organellen vorlagen, lag der Anteil des Hybridproteins bei 33%. Western Blots bestätigten dieses Ergebnis durch eine deutliche Bande der EcICLAgDII im Organellpellet. Damit wurde erstmals die Funktionalität einer ICL-Strukturdomäne II-Sequenz als Organellsignal gezeigt. Auch bei der Rizinus-ICL ist die PTS1-Region entbehrlich für den peroxisomalen Import, der dennoch den PTS1-Rezeptor PEX5 benötigt (Parkes et al., 2003). Zur Überprüfung, ob diese Beziehung ebenso für die PTS1-lose AgICL und das Hybrid EcICLAgDII galt, wurde eine PEX5-Disruptionsmutante erzeugt. Die unveränderte subzelluläre Verteilung beider ICL-Muteine in diesem Stammhintergrund widersprach einer PEX5-Abhängigkeit des Imports. Enzymtests nach differentieller Zentrifugation wiesen 8% der PTS1-losen AgICL bzw. 34% des Hybrids EcICLAgDII im Organellpellet nach. Die Lokalisation der ICLs in den Organellen sowie die Delokalisierung der PEX5-abhängigen Katalase A wurden mit Western Blots bestätigt. Immunodetektion in den Fraktionen von Saccharose-Dichtegradienten zeigte die Co-Lokalisation beider ICL-Muteine mit Thiolase, einem PTS2-Peroxisomenmarker. Die AgICL enthielt daher im Bereich ihrer Strukturdomäne II ein neuartiges, PEX5-unabhängiges Peroxisomensignal. Peroxisomes play a central role in the metabolism of fatty acids and the detoxication of reactive oxygen species, e.g. H2O2 , emerging from oxidation processes. Peroxisomal disorders cause diseases, often due to an import defect of certain enzymes. The two major import pathways of peroxisomal matrix proteins are based on conserved signal sequences. The most common signal is the so-called PTS1, a tripeptide at the end of the C-terminus. More rarely an N terminal nonapeptide (PTS2) occurs. Moreover some proteins contain an additional signal and/or use a hitherto unknown import pathway. For instance only some peroxisomal isocitrate lyases have a PTS1 signal. Isocitrate lyase (ICL) is a key enzyme of the glyoxylate pathway and thus essential for growth on non-fermentable carbon sources. Eukaryotic ICLs are usually localized in the peroxisomes, with the exception of the cytosolic ICL of the baker’s yeast S.cerevisiae. In contrast to this cytosolic ScICL the peroxisomal Ashbya gossypii -ICL contains a PTS1 signal. Therefore the question arose, whether this signal was sufficient to mediate the peroxisomal ICL-import or whether an additional signal was necessary. By fusion of the PTS1-tripeptide AKL or exchange of the C-terminus with that of AgICL an import of 3 - 4% of the modified ScICL was achieved. In the course of this the peroxisomal localization was independently shown by sucrose density centrifugation as well as immuno electron microscopy. Interestingly, the import of heterologously expressed AgICL was far more efficient with approx. 20%. This difference pointed to an additional peroxisomal signal of the AgICL compared with the ScICL. The thesis was supported by muteins without a functional PTS1, which were imported to 20% (AgICL extended by 39 amino acids) or 9% (PTS1 deleted). The signal needed for this import was assumed within the region of the structural domain II of the AgICL and researched with a hybrid protein of the E.coli -ICL. The ICL structural domain II is an internal region of about 100 amino acids, which is missing in prokaryotes. Thus the hybrid protein EcICLAgDII was made by insertion of the AgICL structural domain II (Ag DII). Differential centrifugations displayed a significant peroxisomal localization of this hybrid protein. While - according to activity assays - only 0.7% of the wild type EcICL located in the yeast organelles, the proportion of the hybrid protein was 33%. The result was confirmed by Western blots presenting a clear band of EcICLAgDII within the organellar pellet. Thereby the functionality of an ICL structural domain II sequence as an organellar signal was shown for the first time. In castor bean ICL the PTS1 region is also dispensable for peroxisomal import, which nevertheless requires the PTS1 receptor PEX5 (Parkes et al, 2003). To check whether this relationship also exists for the PTS1-less AgICL and the hybrid EcICLAgDII, a PEX5 disruption mutant was cloned. The unaltered subcellular distribution of both ICL muteins in this strain background contradicted a dependency of the import on PEX5. Enzyme assays demonstrated 8% of the PTS1-less AgICL or 34% of the hybrid EcICLAgDII within the organellar pellet. The localization of the ICLs within the organelles as well as the mislocalization of the PEX5-dependent catalase A were confirmed by Western blots. Immuno-detection within the fractions of sucrose density gradients showed the co-localization of both ICL muteins with thiolase, a PTS2 peroxisomal marker. Hence the AgICL contained a novel, PEX5-independent peroxisomal signal within the region of its structural domain II.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	09.12.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	29.06.2005
Datum der Promotion:	29.06.2005