Dokument: Regulation of stem cell fate and organ development in Arabidopsis thaliana

Titel:	Regulation of stem cell fate and organ development in Arabidopsis thaliana
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3261
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20051209-001261-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Borghi, Lorenzo [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,36 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Simon, Rüdiger [Gutachter] PD Dr. Höcker, Ute [Gutachter]
Stichwörter:	Arabidopsis,Entwiklung,stammzellen,organe,CLV3,LOLLO,auxin,KNOX,meristeme,embryoArabidopsis,development,stem cells, organ,CLV3,LOLLO,auxin,KNOX,meristem,embryo
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Aufgabe des Sprossapikalmeristems (SAM) höherer Pflanzen besteht darin, die Stammzellpopulation während des Lebens der Pflanze zu erhalten, indem es die Balance zwischen Zellproliferation in der zentralen Zone und Zelldifferenzierung in der peripheren Zone erhält. Die beiden Gene CLAVATA3 (CLV3) und LOLLO (LOL) aus Arabidopsis thaliana sind in die Regulierung des Stammzellschicksals und die Differenzierung von Seitenorganen involviert. CLV3 spielt eine zentrale Rolle in der Kontrolle der SAM Aktivität, aber wenig ist über die Regulierung seiner Genexpression bekannt. LOL, ein neu isoliertes Mitglied der LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN (LBD) Genfamilie, wird in den Organanlagen und an den Grenzen zwischen Meristem und Organprimordien exprimiert, wo es hormonelle und genetische Signale zur Erhaltung eines funktionalen Sprossapex integriert. Deletionsanalyse von CLV3 regulatorischen Sequenzen Durch Deletionsanalysen am CLV3 Promoter und dem putativen Verstärkerelement in der 3´ Region, wurden verschiedene Fragmente der CLV3 regulatorischen Sequenzen isoliert, die entweder die CLV3 Expression verstärken oder reprimieren. Aufgrund dieser Resultate wurde ein kombinatorisches Modell für die Regulierung der CLV3 Genexpression aufgestellt. Aufgrund der hohen Redundanz konnten einzelne Motive, die notwendig und hinreichend für die CLV3 Expression im eigenen Muster sind, nicht isoliert werden. Dennoch wurden ein negativer Regulator in der CLV3 Promoter Region und ein positiver Regulator im CLV3 putativen Verstärkerelement identifiziert. Diese beiden Fragmente wurden als Köder in einer Hefe-Ein-Hybrid Durchmusterung eingesetzt, um CLV3 Expression regulierende Transkriptionsfaktoren in der Stammzelldomäne und in differenzierten Zellen zu finden. Die Ergebnisse hierzu werden diskutiert. Wegen der wichtigen Rolle von CLV3 in der Kontrolle der Stammzellpopulation wird die CLV3 Genexpression wahrscheinlich durch viele verschiedene Wege feinreguliert, vielleicht auch durch höher geordnete transkriptionelle Kontrollsysteme wie DNA Methylierung und Chromatin Remodellierung. Einige der identifizierten regulatorischen Regionen könnten für die Rekrutierung von Histon-modifizierenden oder DNA-methylierenden Enzymen am CLV3 Lokus benötigt werden. Zur Zeit durchgeführte Chromatin-Immunopräzipitationsexperimente (ChIP) weisen darauf hin, dass CLV3 tatsächlich einer Chromatinmodifizierung und Repression in Nicht-Stammzellen unterliegt. Charakterisierung von LOL lol-D Mutanten wurden durch eine Aktivierungsmarkierungsmutagenese identifiziert und überexprimieren LOL, einen putativen Transkriptionsfaktor, der zur LBD Genfamilie gehört. Unter den schon charakterisierten LBD Genen sind LATERAL ORGAN BOUNDARY (LOB) und ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2), welche an der Aufrechterhaltung von Organgrenzen und der Initiation von Organprimordien beteiligt sind (Shuai et al. 2002; Lin et al., 2003). LOL wird in Primordienanlagen und an der Grenze zwischen Meristem und jungen Organprimordien exprimiert und scheint die Expression von Genen der KNOTTED-LIKE HOMEOBOX (KNOX) und PIN-FORMED (PIN) Familien zu beeinflussen. KNOX Gene werden für die Aufrechterhaltung der Meristemidentität benötigt; PIN Proteine unterstützen den polaren Transport des Phytohormons Auxin, das für die Organinitiation und Zelldifferenzierung/expansion benötigt wird. In LOL fehlexprimierenden Pflanzen ist die Entwicklung der Organe während der vegetativen Phase betroffen: Blätter sind gelappt und die Organe sind verkleinert. Später während der reproduktiven Phase hört die Organproduktion ganz auf. Die Blattphänotypen der Mutante könnte durch eine stärkere Expression der KNOX Gene erklärt werden, wohingegen das Stoppen der Organproduktion auf einen veränderten Auxintransport zurückgeführt werden könnte. Tatsächlich werden in LOL überexprimierenden Pflanzen zwei KNOX Gene stärker exprimiert, und vier PIN Gene werden weniger stark exprimiert. LOL könnte über die Regulation der KNOX Genexpression den Zellzyklus der Grenzzellen kontrollieren. LOL könnte darüberhinaus über die verminderte Expression der PIN Gene den Auxintransport in jungen Organprimordien regulieren. Um die LOL Funktion weiter zu charakterisieren, wurden lol-1 homozygote Mutanten isoliert. Der lol Funktionsverlust führt zur Embryolethalität. Die Überexpression von lol-DN dominantem Repressor fördert eine partielle Kotyledonenfusion und die Adaxialisierung der Organe. Interessanterweise zeigen vierfach Mutanten für pin1pin3pin4pin7 ebenso Embryolethalität, während arf3/arf4 (auxin response factor) Mutanten auch adaxialisierte Blätter zeigen (Blilou et al., 2005; Pekker et al., 2005). Deswegen können Phänotypen in Pflanzen, die LOL nicht exprimieren oder eine dominant negative Form von LOL exprimieren, durch veränderten Auxintransport bedingt sein. Auch in Affymetrix Microarrays konnte gezeigt werden, dass einige Auxin-induzierte Gene in LOL fehlexprimierenden Pflanzen herunterreguliert sind. Um weitere Erkenntnisse zu erlangen inwiefern LOL in der Kontrolle des Auxintransports involviert ist, müssen in planta Auxintransportuntersuchungen durchgeführt werden. Interessanterweise unterstützen die bis jetzt isolierten drei putativen LOL Interaktionspartner DNA und Histonmethylierung, was darauf hinweist, dass LOL möglicherweise seine Zielgene durch Chromatinremodellierung kontrolliert. The shoot apical meristem (SAM) of higher plants has to maintain the stem cell population during plant life by keeping the balance between cell proliferation in the central zone and cell differentiation in the peripheral zone. CLAVATA3 (CLV3) and LOLLO (LOL) are two Arabidopsis thaliana genes involved in the regulation of stem cell fate and lateral organ differentiation. CLV3 has a central role in controlling SAM activity and stem cell identity, but little is known about the regulation of its expression. LOL, a newly isolated member of the LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN (LBD) gene family, expressed in organ anlagen and in the boundaries between meristem and organ primordia, can act to integrate gene activities and hormonal signalling to control organ development. Deletion analysis of CLV3 regulatory sequences By deletion analyses of the CLV3 promoter and downstream putative enhancer, different fragments of the CLV3 regulatory sequences, required to promote or repress CLV3 expression, were isolated. On these results, a combinatorial model of CLV3 expression regulation is hypothesized. Due to high redundancy, single motives necessary and sufficient to promote CLV3 in its own pattern were not isolated. However, a negative regulator of CLV3 expression in the CLV3 promoter and a positive regulator in the CLV3 putative enhancer were identified. These two fragments were used as baits to isolate, by yeast one-hybrid screens, transcription factors regulating CLV3 expression in the stem cell domain and in differentiated cells. Results are discussed. Due to its importance in controlling the stem cell population, CLV3 expression is probably finely regulated by many different pathways, possibly including also high-level transcription control systems like DNA methylation and chromatin remodelling. Some of the identified regulatory regions could be required for the recruitment of histone modifying or DNA methylation enzymes at the CLV3 locus. Current chromatin immuno precipitation (ChIP) experiments indicate that CLV3 is indeed subject to chromatin modification and repression in non-stem cells. Characterization of LOL lol-D mutant plants, identified after an activation tagging mutagenesis, are shown to ectopically express LOL, a putative transcription factor belonging to the LBD gene family. Among the few already characterized LBD genes are LATERAL ORGAN BOUNDARY (LOB) and ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2), involved in maintenance of lateral organ boundaries and specification of organ primordia, respectively (Shuai et al., 2002; Lin et al., 2003). LOL, expressed in primordia anlagen and in the boundaries between meristem and young organ primordia, seems to affect the expression of genes belonging to the KNOTTED-LIKE HOMEOBOX (KNOX) and PIN-FORMED (PIN) families. KNOX genes are required to maintain meristem identity; PIN proteins facilitate the polar transport of the phytohormone auxin, required for organ initiation and cell differentiation/expansion. In LOL mis-expressing plants, the development of lateral organs is affected during the vegetative stage: leaves are lobed and organ size is reduced. Later, during the reproductive stage, organ production arrests. The leaf mutant phenotype may be promoted by an up-regulation of KNOX gene expression, while organ production arrest could be due to altered auxin transport. Indeed, two KNOX genes were found to be up-regulated, while four PIN genes were down-regulated in LOL overexpressing plants. LOL, through the regulation of KNOX gene expression, could control the cell cycle of boundary cells. LOL, via the down-regulation of PIN expressions, could regulate auxin transport in young organ primordia. To characterize the LOL function, lol-1 homozygous mutants were isolated. lol loss of function causes embryo lethality. Overexpression of a lol-DN dominant repressor promotes partial cotyledon fusion and lateral organ adaxialization. Interestingly, quadruple mutants for pin1pin3pin4pin7 are also embryo lethal, while mutant plants for arf3/arf4, two auxin response factors, have also adaxialized leaves (Blilou et al., 2005; Pekker et al., 2005). Therefore, also in plants where LOL is not expressed, or where its dominant negative version is ectopically expressed, mutant phenotypes could be caused by altered auxin transport. In line with this, Affymetrix micro array analysis showed that several auxin inducible genes are down-regulated in LOL mis-expressing plants. To understand if indeed LOL is involved in the control of auxin transport, in planta auxin transport assays have to be performed. Interestingly, the putative LOL interaction partners until now isolated promote DNA and histone methylation, thus indicating that possibly LOL controls its target genes by acting on chromatin remodelling.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	09.12.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	07.12.2005
Datum der Promotion:	07.12.2005