Dokument: Isolationsverfahren für den peripheren Arm des Atmungsketten-Komplex I aus Neurospora crassa
| Titel: | Isolationsverfahren für den peripheren Arm des Atmungsketten-Komplex I aus Neurospora crassa | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3253 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20051205-001253-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Borgs, Thorsten [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Komplex I, Atmungskette, Neurospora crassa, Membranprotein, Proteinchemie, chaotopes Salz, Affinitätschromatographie, His-Tag, Detergentien, | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibung: | Der Atmungskettenkomplex I koppelt die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon mit der Translokation von vier Protonen über die innere Mitochondrienmembran. Der Mechanismus der elektronengetriebenen Protonentranslokation ist unverstanden, da es bislang nicht gelang eine hochaufgelöste Kristallstruktur des Komplex I zu bestimmen. Ein Grund dafür kann in der Größe und Struktur des Komplex I liegen sowie in den über viele Schritte verlaufenden und das Protein stark beanspruchenden Präparationsverfahren. In unserem Institut wird deswegen versucht, die beiden Arme des Komplex I getrennt zu isolieren und kristallisieren. Zur Präparation des peripheren Arms des Komplex I wurde bisher von einer Neurospora crassa-Mutante (Mutante nuo20.9) ausgegangen, in der ein Gen einer 20.9 kDa Untereinheit des Membranarms von Komplex I ausgeschaltete worden war und deswegen nur noch den peripheren Arm assemblieren kann. Die Präparation erstreckte über vier Reinigungsschritte und endete mit einer geringen Ausbeute. In dieser Doktorarbeit wurde nach Alternativen zu diesem Präparationsverfahren des peripheren Arms gesucht, die es erlauben, das Protein schonender und mit besserer Ausbeute zu isolieren. Zwei Ansätze wurden verfolgt. Zum einen wurde der periphere Arm durch Spaltung des zuvor isolierten Komplex I mit dem chaotropen Salz Kaliumrhodanid, Zuckergradientenzentrifugation in Anwesenheit von Rhodanid und anschließender Anionenaustausch-chromatographie gewonnen. 800 g Hyphen ergaben so 2 mg des peripheren Arms, der jedoch nur in Anwesenheit von Detergenz löslich war. Zum andern wurde eine Untereinheit des peripheren Arms aus einer Mutante, die nur den peripheren Arm assemblieren kann, mit einem His-Tag versehen und der periphere Arm durch Affinitätschromatographie an Ni-NTA und Grössenausschlußchromatographie aufgereinigt. Aus 800 g Hyphen wurden auf diesem Weg 3.5 mg des peripheren Arms in wasserlöslicher Form erhalten. Für eine Kristallisation scheint somit die Präparation des peripheren Arms mit der Affinitätsmarkierung erfolgversprechender. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 05.12.2005 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 02.12.2005 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.12.2005 |
