Dokument: Charakterisierung der Ausscheidung von L-Glutamat bei Corynebacterium glutamicum
| Titel: | Charakterisierung der Ausscheidung von L-Glutamat bei Corynebacterium glutamicum | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3230 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20051028-001230-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Stansen, Kathrin Corinna [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Glutamat, Lactat, Corynebacterium glutamicum, Transport, L-Lactat-Dehydrogenase, DNA-Chip-Analyse, Ethambutol, Tween, Biotin-Mangel, Osmostressglutamate, lactate, Corynebacterium glutamicum, transport, L-lactate-dehydrogenase, microarray, ethambutol, tween, biotin limitation, osmotic shock | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Mit Hilfe von Corynebacterium glutamicum werden jährlich 1,5 Millionen Tonnen L-Glutamat produziert. Dennoch konnte bislang weder ein L-Glutamat-Exporter identifiziert werden, noch ist genau verstanden, warum die Exkretion von L-Glutamat immer erst nach Induktion durch verschiedenste Auslöser erfolgt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit fünf Methoden der Glutamatausscheidung etabliert und die genomweiten Genexpressionsmuster unter diesen Induktionsbedingungen quantifiziert. Durch die Auslöser der Glutamatausscheidung Ethambutol und Tween40 wurden 74 bzw. 137 Gene differentiell exprimiert, durch Biotin-Mangel und Penicillin aber nur 19 bzw. 18 Gene. Überraschenderweise zeigte sich kein Expressionsmuster, welches unabhängig von der Art der Induktion stets bei der Ausscheidung von L-Glutamat auftritt. Ebenso überraschend war, dass trotz stark verändertem Zentralstoffwechsel während der Ausscheidung von L-Glutamat keine veränderte Expression von Genen z.B. der Enzyme des Pentosephosphatwegs oder der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase auftritt, was eher auf eine Regulation der Stoffflüsse auf Protein-, bzw. Aktivitätsebene schließen lässt. Es gab jedoch spezifische und teilweise sogar extreme Expressionsveränderungen. So führten Ethambutol und Tween40 zu einem bis zu 31-fach erhöhten mRNA-Spiegel von mepA, das vermutlich für eine Metalloendopeptidase kodiert, und zu einem zweifach reduzierten mRNA-Spiegel von accBC, welches für die α-Untereinheit der Acetyl-CoA-Carboxylase kodiert. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf die Beeinflussung der Zellwandstruktur unter diesen Induktionsbedingungen. Auch das für einen mechanosensitiven Kanal der Osmoregulation kodierende yggB wurde durch Ethambutol und Tween40 bis zu vierfach verstärkt exprimiert. Durch zusätzliche Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass unabhängig von der Art der Induktion hyperosmotischer Schock die Exkretion drastisch reduziert, während hypoosmotischer Stress die Ausscheidung steigert. Aufgrund dessen ist anzunehmen, dass der noch zu identifizierende L-Glutamat-Exporter durch die Membranspannung in seiner Aktivität beeinflusst wird, worüber auch ein Zusammenhang mit der Zellwand als bekannter Wirkort der verschiedenen Auslöser der Glutamatausscheidung hergestellt werden könnte. Die genomweiten Expressionsanalysen ergaben, dass 13 Gene, die für putative Transporter und Membranproteine kodieren, nach Induktion der Glutamatausscheidung verstärkt exprimiert werden. Durch Inaktivierung konnte für die meisten dieser Gene gezeigt werden, dass sie weder die Ausscheidung von L-Glutamat noch das Wachstum beeinflussen. Diese Gene sind somit als nicht-essentiell zu betrachten. Die Inaktivierung des Gens NCgl0944 führte zu einer deutlichen Reduktion der L-Glutamat-Exkretion nach Induktion durch Biotin-Mangel, Ethambutol und Penicillin. Eine weitere Mutante, in der das Gen NCgl2566 deletiert war, exkretierte dagegen nach Induktion durch Tween40 kaum noch L-Glutamat. Aus den Ergebnissen kann geschlossen werden, dass diese zwei Transporter direkt oder indirekt in die Glutamatausscheidung involviert sind. Während der Temperatur-induzierten Glutamatausscheidung wurden die zwei benachbart liegenden Gene NCgl2816 und NCgl2817 verstärkt exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Gene durch L-Lactat induziert werden und als Operon vorliegen. Enzymtests zeigten, dass NCgl2817 für eine L-Lactat-Dehydrogenase kodiert. Das Enzym oxidiert L-Lactat Quinon-abhängig zu Pyruvat und weist einen Km-Wert von 0,5 mM für das einzige Substrat L-Lactat auf. Die Analyse einer Inaktivierungsmutante ergab, dass dieses lldD genannte Gen die Verwertung von L-Lactat essentiell ist, wogegen das kotranskribierte Gen sehr wahrscheinlich die L-Lactat-Aufnahme katalysiert.With the help of Corynebacterium glutamicum L-glutamate is produced with a current annual scale of 1.5 million tons. Yet, until now neither an L-glutamate export system could be identified nor do we exactly understand why glutamate excretion always requires induction by most deceased triggers. For this reason five methods of L-glutamate production were established and global gene expression patterns of these inducing conditions quantified. While presence of the triggers ethambutol or Tween40 lead to differential expression of 74, respectively 137 genes, biotin limitation and penicillin addition influenced mRNA levels of only 19, respectively 18 genes. Surprisingly, there exists no common expression pattern of L-glutamate excretion which occurs independently of the trigger used. Surprisingly, too, was the fact that though central metabolism was altered the expression genes of e.g. pentosephosphate pathway or the oxoglutarate dehydrogenase remained unaffected. Possibly, regulation of metabolic fluxes occurs rather on level of protein or activity. Nethertheless, specific and in some part extreme expression changes could be detected. For example, ethambutol and Tween40 led to an up to 31-fold increased mRNA level of mepA coding for a metalloendopeptidase and a twofold reduced mRNA level of accBC, which encodes the α-subunit of acetyl-CoA carboxylase. This clearly points to an affection of the cell wall structure under these induction conditions. Also, a gene encoding a mechanosensitive channel of osmoregulation, yggB, showed up to fourfold increased expression in presence of ethambutol and Tween40. Subsequent analysis revealed a dependence of L-glutamate excretion on the osmolality of the medium: hyperosmotic shock decreased L-glutamate formation irrespectively of the trigger used, while hypoosmotic shock had a stimulating influence. On the basis of these facts we can assume that membrane tension affects the activity of the yet unidentified L-glutamate exporter implicating the cell wall as known target of the various triggers of L-glutamate excretion. By means of genomewide expression analysis 13 genes were identified which code for transporters or membrane proteins and showed increased expression after induction of L-glutamate excretion. Apart from few exceptions, inactivation of these genes affected neither L-glutamate excretion nor growth. Thus, these genes can be classified as non-essential. In contrast, inactivation of NCgl944 led to clearly reduced L-glutamate excretion triggerd by biotin limitation as well as addition of ethambutol or penicillin, whereas deletion of NCgl2566 resulted in reduced excretion in presence of the trigger Tween40. The results point to a direct or indirect involvement of these two transporters in excretion of L-glutamate. During temperature-triggered L-glutamate excretion expression of two adjacent genes was strongly increased. Both genes constitute an operon which is induced by L-lactate. NCgl2817 was demonstrated to encode an L-lactate dehydrogenase, which was named LldD. This enzyme displayed quinone-dependent oxidation of L-lactate to pyruvate with a Km value of 0.5 mM for its only substrate L-lactate. Disruption of the operon resulted in loss of the ability to utilize L-lactate as the sole carbon source. Expression of lldD restored L-lactate utilization, indicating that the function of the permease gene NCgl2816 is dispensable, while lldD is essential for growth of C. glutamicum on L-lactate. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.10.2005 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 29.06.2005 | |||||||
| Datum der Promotion: | 29.06.2005 |
