Dokument: Analyse der Bindungsspezifität der humanen Lck-SH3- Domäne anhand artifizieller und physiologischer Peptid-Liganden und strukturelle Charakterisierung dieser Peptide im Komplex mit SH3-Domänen
| Titel: | Analyse der Bindungsspezifität der humanen Lck-SH3- Domäne anhand artifizieller und physiologischer Peptid-Liganden und strukturelle Charakterisierung dieser Peptide im Komplex mit SH3-Domänen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3225 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20051019-001225-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Tran, Thi Tuyen [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Stoldt, Matthias [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Lck, SH3 Domäne, NMR, PxxP, Kinase, Struktur, Src, Phagendisplay, KD, PeptidLck, SH3 domain, NMR, PxxP, Kinase, structure, Src, phage display, KD, peptide | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Lymphocytenspezifische Kinase Lck ist eine Protein-Tyrosin-Kinase, die eine wichtige Rolle bei der Immunantwort innerhalb der T-Zelle einnimmt. Sie ist essentiell für die Proliferation und Differenzierung der T-Zellen. Durch die Weitergabe des Rezeptorsignals nach Antigen-Stimulierung ist sie an der Aktivierung anderer Kinasen und damit an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt. Aufgrund dessen stellt sie auch einen Angriffspunkt für virale Effektormoleküle dar. Das Verständnis der Interaktion von Lck mit ihren Liganden bringt nicht nur weite Einblicke in allgemeine Prinzipien der Protein-Protein-Wechselwirkungen. Sie kann auch als Basis für die Entwicklung neuer Medikamente dienen, um in die Aktivität der Lck einzugreifen und die Immunantwort zu beeinflussen und somit auch virale Infektionen bekämpfen zu können. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Liganden-Spezifität der Lck-SH3-Domäne. Mittels Phagendisplay-Selektion ist es erstmals gelungen, artifizielle Peptid-Liganden für die humane Lck-SH3-Domäne zu identifizieren und daraus eine Konsensus-Sequenz für die Lck-SH3-Erkennung von Peptiden abzuleiten. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass Lck-SH3 in vitro bevorzugt an Klasse-I-Liganden binden. Alle bekannten physiologischen Bindungspartner der Lck-SH3 jedoch binden in Klasse-II-Orientierung. Für das Peptid PD1-R konnte das Histidin an der Position P-6 als essentiell für eine Lck-SH3-Bindung identifiziert werden. Weiterhin konnten erstmals für die nativen Lck-SH3-Bindungspartner c-Cbl, Cbl-b, Sam68 und FasL die dazugehörigen Lck-SH3-Bindungsregionen innerhalb dieser Proteine identifiziert werden. Mit Hilfe von NMR-Titrationsexperimenten konnten die Wechselwirkungen der neuen Peptid-Liganden PD1 und PD1-R bestätigt und auf der Oberfläche von Lck-SH3 kartiert werden. Weiterhin ist es in dieser Arbeit gelungen, HIV-1-Nef von der Lck-SH3-Domäne durch das Peptid PD1-R kompetitiv zu verdrängen. Im weiteren Rahmen der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Peptide PD1 und PD1-R mit einer Dissoziationskonstante von wenigen hundert nanomolar an die SH3-Domäne der hämatopoetischen Kinase Hck binden. Die Bindung zwischen Hck-SH3 und PD1 ist derzeit die affinste bekannte SH3:Peptid-Interaktion. Selbst die hochaffine Bindung von HIV-1-Nef an die Hck-SH3 (KD=0,25 µM) konnte durch das Peptid PD1 verhindert werden. Dies wurde durch ein NMR-Kompetitionsexperiment nachgewiesen. Ferner wurden in dieser Arbeit Bedingungen definiert, die eine hochauflösende, drei-dimensionale Strukturbestimmung der Komplexe Lck-SH3:PD1-R und Hck-SH3:PD1 ermöglichen. Die drei-dimensionalen Strukturen werden die ersten Komplexstrukturen von Lck-SH3 und Hck-SH3 mit einem Peptid-Liganden sein.Lck is a lymphoid-specific cytosolic protein tyrosine kinase, which plays a key role in the immune response and is essential for T-cell development and function. Upon antigen stimulation, Lck transduces the receptor signal to other kinases and intracellular signal transduction components. Because of its important role in T-cell signalling and activation, Lck is a target of viral effector molecules. Understanding the mode of their interaction provides not only an insight into general principles of protein-protein interaction. It also may serve as a basis for the development of new drugs capable of modifying Lck activity. The objective of the presented work was to identify the binding specificity of the Lck-SH3 domain. By employing a phage display selection procedure artificial peptide ligands for Lck-SH3 domain could be identified and subsequently a consensus sequence for Lck-SH3 ligands was deduced. For the first time, it was shown, that in vitro Lck SH3 binds preferentially to class I ligands. All known physiological binding partners however bind to Lck-SH3 in a class II orientation. Histidin at position P-6 within the peptide PD1-R was identified to be essential for Lck-SH3 binding. For the first time, the Lck-SH3 binding regions of the physiological Lck-SH3 binding partners c-Cbl, Cbl-b, Sam68 und FasL were identified. Employing NMR titration studies, interactions of the new peptide ligands PD1 and PD1-R to Lck-SH3 were confirmed, and their binding regions on the surface of Lck-SH3 were mapped. Moreover, HIV-1 Nef could be competitively displaced from Lck-SH3 by the peptide PD1-R. Furthermore, it was shown that the peptides PD1 and PD1-R bind to the SH3 domain of the haematopoietic cell kinase Hck with a dissociation constant of a few hundred nanomolar. The PD1:Hck-SH3 interaction thus is the tightest SH3:peptid interaction known to date. Even the tight binding of HIV-1 Nef to Hck-SH3 (KD=0.25 µM) could be inhibited by PD1. This was demonstrated by a NMR competition experiment. In addition, conditions for the complex of Lck-SH3 with PD1-R and Hck-SH3 with PD1 were defined, which paved the way for high resolution structures of both complexes. They will be the first complex structures of Lck-SH3 and Hck-SH3 with a peptide ligand. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 19.10.2005 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 14.07.2005 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.07.2005 |
