Dokument:
Entwicklung einer tumorspezifischen Suizidgentherapie
für Osteosarkome
| Titel: | Entwicklung einer tumorspezifischen Suizidgentherapie für Osteosarkome | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3193 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20050825-001193-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bienemann, Klaus [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Kramm, Christof [Gutachter] Prof. Dr. Krutmann, Jean [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Osteosarkom, Gentherapie, Suizidgentherapie, Lentivirus, Methotrexat,osteosarcoma, gene-therapy, suicide-gene-therapy, lentivirus, lentivirus mediated infection, methotrexate | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Grundlagen für eine Osteosarkom-spezifische Suizidgentherapie zu entwickeln. Dabei wurde nicht auf einen Vertreter der klassischen Suizidgentherapie zurückgegriffen, da die Wirkung eines Enzymgens, welches in transdu-zierten Tumorzellen eine inaktive Substanzvorstufe (prodrug") in einen toxischen Meta-boliten umwandelt, sich in der Klinik aufgrund einer unbefriedigenden Gentransferrate leider nicht bewährt hat. In der vorliegenden Arbeit wurde vielmehr das humane Folylpo-lyglutamatsynthetase-Gen (hfpgs)-System gewählt. Durch dieses Enzymgen wird keine inerte Substanz aktiviert, sondern es wird das an sich schon sehr toxische Chemothera-peutikum Methotrexat (MTX) in seiner Wirkung deutlich verstärkt. Hierdurch hängt der gesamte Therapieerfolg nicht von der Suizidgentherapie als alleinigem Wirkungsprinzip ab, sondern die Suizidgentherapie wird adjuvant zu einem etablierten Therapieverfahren angewandt. Als Vektorsystem wurden in der vorliegenden Arbeit lentivirale Vektoren verwendet, da diese unter den zur Zeit verfügbaren Gentransfersystemen die beste Transduktionseffizienz versprachen. Um die Toxizität des lentiviralen Suizidgentransfers weitgehend auf Osteosarkomzellen zu beschränken, wurde zur Suizidgenexpression der osteosarkomspezifische Osteocalcin-Promotor verwendet. Die Osteosarkom-Spezifität des neu klonierten Osteocalcin-Promotorfragmentes wurde vorab mittels Luciferase (Luc)-Reportergen-Assays bestätigt. Für die eigentlichen Suizidgenexpressionsstudien wurde das Reportergen egfp über eine ires2-Site an das Suizidgen hfpgs gekoppelt, um die Sui-zidgenexpression und die Promotorspezifität kontinuierlich monitoren zu können. Die ge-samte hfpgs-ires2-egfp-Transkriptionskassette wurde dann in ein lentivirales Vektorsys-tem kloniert. Mit den generierten lentiviralen Überständen zeigte sich beim Osteocalcin-Promotor sowohl in der egfp-Expression als auch in der MTX-Sensitivität ein deutlicher Unterschied zwischen Osteosarkomzellen und nicht osteogenen Zellen. Die Osteosarkom-Spezifität des Osteocalcinpromtors liess sich dabei noch einmal durch Zusatz von Vitamin D3 signifikant erhöhen. Die hier vorgestellte Suizidgentherapiestrategie mit einem lentivi-ralen Vektor und einer Expressionskassette, bestehend aus Osteocalcin-Promtor und hfpgs-Gen, stellt insgesamt einen vielversprechenden Ansatz zur Wirkungsverstärkung einer konventionellen Methotrexat-Chemotherapie dar. Zukünftige präklinische Versuche werden dieses System in einem einfachen und einem disseminierten Osteosarkomtier-modell testen.The antifolate methotrexate (MTX) is an important chemotherapeutic agent for treatment of osteosarcomas. This drug usually converts intracellulary into polyglutamate derivates by the enzyme folylpolyglutamate synthetase (FPGS). MTX polyglutamates show an enhanced and prolonged cytotoxicity in comparison to the monoglutamate. We, therefore, investigated in the present study if transfer of the human fpgs gene to osteosarcoma cells may augment their MTX sensitivity. For this purpose, we employed the human osteocalcin (OC) promoter which had shown marked osteosarcoma specificity in promoter studies using different luciferase assays in osteosarcoma and non-osteosarcoma cell lines. A recombinant lentiviral vector was generated with the OC promoter driving the expression of fpgs and the gene for enhanced green fluorescent protein (egfp) which was linked to fpgs by an internal ribosomal entry site (IRES). Since the vector backbone contained only a self-inactivating viral LTR promoter, any interference of the OC promoter by unspecific promoter elements was excluded. We tested the expression of fpgs and egfp after lentiviral transduction in various osteosarcoma (murine ROS, human MG-63, human TM791) and non osteoblastic cell lines (293T embryonic human kidney cells, HeLa human cervix carcinoma cells) by assessing egfp expression and MTX sensitivity in comparison to non-transduced controls. Whereas the OC promoter failed to enhance MTX sensitivity via fpgs expression in non osteoblastic cell lines, the OC promoter mediated a markedly increased MTX cytotoxicity in all osteosarcoma cell lines after lentiviral transduction. In future animal studies, we will investigate if our lentiviral-mediated chemogene therapy approach also confers osteosarcoma-selective cytotoxicity in vivo. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.08.2005 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.06.2005 | |||||||
| Datum der Promotion: | 20.06.2005 |
