Dokument: Antisense Inhibition of Inducible Nitric Oxide Synthase Expression - Does it make Sense?

Titel:	Antisense Inhibition of Inducible Nitric Oxide Synthase Expression - Does it make Sense?
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3183
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050806-001183-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hemmrich, Karsten [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,15 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Kolb-Bachofen, Victoria [Gutachter] Prof. Dr. Kleinert, Hartmut [Gutachter]
Stichwörter:	Antisense-Technik, induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase, Stickstoffmonoxid, Stressantwort, Oligonukleotide, VEGF, HO-1, Bcl-2antisense technology, inducible nitric oxide synthase, nitric oxide, stress-response genes, oligonucleotides, VEGF, HO-1, Bcl-2
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Bedeutung von Stickstoffmonoxid (NO), welches durch eine induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) aus Arginin nach Aktivierung durch proinflammatorische Zytokine oder durch Bakterienbestandteile gebildet wird, ist immer noch widersprüchlich. Die Expression der iNOS im Rahmen von Entzündungen ist vorwiegend zu finden in Zellen epithelialen Ursprungs. In diesem Kontext wirkt NO protektiv durch Begrenzung von Gewebsschäden und durch Hemmung der Ausbreitung von Pathogenen. Die lokale Entzündungsreaktion wird so limitiert durch Anstoßung einer Th2-Antwort im Sinne eines klassischen Feedback-Mechanismus. Allerdings weist die Literatur der iNOS bzgl. chronischer Krankheiten mit vorwiegend Th1-gesteuerten Reaktionen eine destruktive Rolle zu. Für diese Konstellationen erscheint eine spezifische Enzymhemmung überaus wertvoll. Diverse Methoden zur iNOS-Hemmung sind in der Vergangenheit schon etabliert worden, um die Kontroverse von protektiver versus destruktiver Wirkung von NO klären zu können. Die Antisense-mediierte Genhemmung stellt eine relativ neue Methode zur Hemmung der NO-Produktion dar. Da Endothelzellen ein besonders geeignetes Ziel für eine potentielle in vivo Anwendung der Antisensetechnik darstellen, beschäftigt sich diese Dissertation mit der Etablierung und Optimierung der Antisensemethodik an primären Rattenendothelzellen. Vorgestellt wird ein optimiertes Protokoll für die iNOS-Hemmung in Endothelzellen mit Ergebnissen über die Aufnahme fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide (ODN), die Einflüsse von Serum im Medium sowie die Unterschiede zwischen verschiedenen Lipiden, die zur Verbesserung der ODN-Aufnahme getestet wurden. Die Ergebnisse werden eingebettet in die Diskussion über bereits etablierte Techniken sowie deren Erfolge. Dabei geht es insbesondere um das Design von Antisense-Experimenten: Wie sollen ODN aussehen, wie kann die Aufnahme der ODN nach intrazellulär sichergestellt werden und wie kann diese zelluläre Inkorporation adäquat kontrolliert und dargestellt werden. Zwar konnte eine 95%ige iNOS-Hemmung erreicht werden, jedoch zeigte sich dabei auch eine Hemmung der protektiven, NO-gesteuerten Gene bcl-2, VEGF und Hämoxygenase-1. Diese Expressionhemmung protektiver Gene ließ sich auch bei Kultivierung der Endothelzellen in Arginine-armem Medium demonstrieren, da hier aufgrund von Substratmangel trotz Stimulation der iNOS durch Zytokine kaum NO produziert wurde. Unsere Ergebnisse zeigen somit, daß eine iNOS-Hemmung durch Antisense-ODN zwar möglich ist, jedoch aufgrund der Nebenwirkungen höchst kritisch zu betrachten ist. Zum Schutz und zur Funktionserhaltung des Endothels erweist sich die iNOS als extrem wichtig. Eine Hemmung des Enzyms genauso wie niedrige Argininspiegel, wie sie z.B. im Rahmen der Atherosklerose auftreten, fördern endotheliale Schädigung und Dysfunktion. The impact of nitric oxide (NO) synthesized from arginine after activation by proinflammatory cytokines and/or bacterial products by an inducible NO synthase (iNOS) is still contradictory. Expression of iNOS in inflammatory reactions is often found predominantly in cells of epithelial origin, and in these cases NO may serve as a protective agent limiting pathogen spreading, downregulating local inflammatory reactions by inducing production of Th2-like responses in a classical feedback circle, or limiting tissue damage during stress conditions. However, an abundant amount of data on chronic human disorders with predominant proinflammatory Th1-like reactions points to a destructive role of iNOS activity calling for a specific inhibition. Various methods to inhibit iNOS have been established to elucidate a protective versus destructive role of NO during various stresses. This thesis deals with antisense (AS)-mediated gene knock-down as a relatively new method to inhibit NO production and summarizes the techniques applied and their successes. Also included in the analyses is the effect of AS-mediated iNOS inhibition on NO-regulated genes. Especially stressed is the question of how to design AS experiments properly, e.g. how should ODN be configured, how is ODN incorporation ensured, and how can ODN uptake be monitored adequately. Since endothelial cells (EC) represent prime candidate cells for an in vivo application of AS-ODN, this work aimed at optimizing the AS-technique for effectiveness and specificity in primary non-transformed rat EC. Presented is an optimized protocol for AS-mediated knock-down of iNOS in EC with detailed information on the uptake of fluorescence-labeled ODN, the effects of serum presence during ODN uptake, and the differences between various cationic lipids as uptake enhancers. Using AS-ODN, a block of iNOS protein formation was achieved, accompanied by a strong decrease in the expression of the protective, NO-regulated stress response genes bcl-2, VEGF, and HO-1. Additionally, EC were also maintained in the presence of limited exogenous substrate concentrations during cytokine challenge, thereby mimicking a situation of low serum arginine level during inflammation. Under these conditions, cytokine addition resulted in full iNOS protein expression with minimal NO formation, concomitant with a significant reduction in stress response gene expression, and susceptibility to cell death induced by reactive oxygen species. Taken together, our findings suggest that cytokine-induced endogenous iNOS expression and activity have key functions in increasing endothelial survival and maintaining function. Thus, suppression of iNOS expression or limited substrate supply as has been reported to occur in diseases like atherosclerosis appear to significantly contribute to endothelial dysfunction and death during oxidative stress.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	06.08.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	13.07.2005
Datum der Promotion:	13.07.2005