Dokument: Biochemical and pharmacological modulation of scarring, axon regeneration and long-term functional improvement after spinal cord injury in rat

Titel:Biochemical and pharmacological modulation of scarring, axon regeneration and long-term functional improvement after spinal cord injury in rat
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20141030-112857-6
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Englisch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: König, Brigitte [Autor]
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Dateien vom 29.10.2014 / geändert 29.10.2014
Beitragende:Prof. Dr. Müller, Hans Werner [Gutachter]
Prof. Dr. Rose, Christine R. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Traumatische Verletzungen des Rückenmarks führen zur Ausbildung einer kollagenhaltigen fibrösen Narbe im Läsionszentrum. Diese Narbe zeichnet sich durch eine dichte Extrazellulärmatrix aus, die aufgrund der Akkumulation verschiedener wachstumshemmender Moleküle als Barriere für regenerierende Nervenfasern angesehen wird. In unserer Arbeits-gruppe wurde eine Therapie zur Unterdrückung dieser Narbenbildung (anti-scarring treatment, AST) bestehend aus dem Eisenchelator 2,2'-Bipyridin-5,5'-dicarbonsäure (BPY-DCA) zur Hemmung der Prolyl-4-Hydroxylase und 8-Brom-zyklisches Adenosin-Monophos-phat (8-Br-cAMP) zur Hemmung der CTGF-Expression im verletzten Rückenmark entwickelt. Die lokalen Injektionen des ASTs ins verletzte Rückenmark bewirkten axonale Regeneration und partiell funktionelle Erholung. Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse ist eine medizinische Anwendung im Menschen aufgrund des Lösungsmittels (Tris) für den Eisenchelator und der Applikationsweise, die auch Injektionen ins intakte Rückenmark beinhaltet, sehr unwahrscheinlich. In der vorliegenden Arbeit wurde das Injektionsverfahren durch die klinisch weit verbreitete intrathekale Katheter-Infusion ersetzt. Aufgrund des sehr engen Subarachnoidalraumes in der Ratte wird bei einer langfristigen intrathekalen Katheterisierung oft eine starke Narbenbildung und Kompression des Rückenmarks beobachtet. Die vorliegende Arbeit, hingegen, beschreibt eine intrathekale Katheterapplikationsweise in Kombination mit einer osmotischen Minipumpe, die eine uneingeschränkte Wirkstoffapplikation über mindestens 2 Wochen ermöglicht ohne weitere Beeinträchtigungen des Rückenmarks hervorzurufen. Im Vergleich zu BPY-DCA wurde die Reduktionsstärke der Eisenchelatoren 2,2'-Bipyridin (BPY) und Deferoxaminmesilat (DFO) auf die kollagene Narbenbildung nach einer dorsalen thorakalen Hemisektion auf Höhe Th8 untersucht. Die Quantifizierung des Prozentanteils an Coll IV positiven Pixeln im Narbenareal ergab, dass alle 3 Eisenchelatoren, die für 7 Tage intrathekal infundiert wurden, signifikant die kollagene Narbenbildung reduzierten. In den früheren AST-Injektionsstudien hingegen war eine zusätzliche Injektion von 8-Br-cAMP für eine effektive Kollagenreduktion unerlässlich. Da DFO insgesamt ein breiteres Kollagen-Reduktionspotential aufweist als BPY und zusätzlich den Status eines geprüften Medikamentes hat, wurde für die weiteren Untersuchungen DFO ausgewählt. Darüber hinaus könnte DFO auch systemisch appliziert werden. Ein Vergleich zwischen intrathekal infundiertem und täglich systemisch (i.p.) appliziertem DFO über 14 Tage zeigte, dass systemisch verabreichtes DFO ebenso effektiv die Narbe reduzieren kann wie intrathekal infundiertes DFO. Ferner konnte durch die quantitative Auswertung der Blutgefäßdichte in der Narbe die Angiogenese fördernde Wirkung von DFO bestätigt werden. Die Untersuchung der funktionellen Regeneration im Offenfeld-Test (BBB), Gridwalk sowie im CatWalk über einen Zeitraum von 16 Wochen offenbarte jedoch, dass eine 2-wöchige intrathekale DFO-Infusion nicht ausreichend ist, um eine langanhaltende funktionelle Erholung zu bewirken. Da allerdings in den ersten Wochen der Verhaltensanalysen funktionelle Verbesserungen in der feinmotorischen Lokomotion beobachtet werden konnten, scheint DFO ein gewisses regeneratives Potential zu besitzen, aber vermutlich sind längere Behandlungszeiträume notwendig um langanhaltende Regeneration auszulösen. Bei der histologischen Untersuchung wurde kein Unterschied bezüglich regenerierter Axone zwischen DFO und der Kontrollgruppe festgestellt. Lediglich ein Trend zu reduzierten Läsionsgrößen und verbessertem Gewebeerhalt war erkennbar. Aufgrund der generell nur begrenzt auftretenden axonalen Regeneration im adulten ZNS wurde zusätzlich eine Kombinationstherapie mit dem Chemokin Stromal Cell-Derived Factor 1α (SDF-1α/CXCL12), das axonales Aussprossen fördert, untersucht. Im Gegensatz zu den moderaten Einzelwirkungen induzierte die gleichzeitige Verabreichung von DFO und SDF-1α signifikant langanhaltende Verbesserung fein-motorischer Bewegung. Die allgemeine Lokomotion und dessen Gangeigenschaften wurden jedoch durch die kombinatorische Behandlung nicht markant verbessert. Die histologischen Analysen ergaben weiterhin, dass DFO+SDF-1α weder den Gewebeerhalt noch die Regeneration des für die Lokomotorik wichtigen Kortikospinaltraktes (CST) verbessert, allerdings erhöhte es die Axondichte von aufsteigenden sensorischen Fasern in der Läsionsnarbe. Dies könnte zu den beobachteten funktionellen Verbesserungen beigetragen haben. Das Überraschendste dieser Studie war allerdings, dass BSA, das als Vehikel-Kontrolle für SDF-1α eingesetzt wurde, wirksamer die funktionelle Regeneration förderte als DFO und SDF-1α zusammen. In allen funktionellen Analysen (Ausnahme BBB) hatte die BSA-Behandlung immer die stärkste funktionelle Erholung zur Folge und war bereits ab dem ersten Testzeitpunkt offensichtlich. Früh auftretende funktionelle Erholung ist ein Hinweis auf eine neuroprotektive Wirkung, die durch die signifikant reduzierte Läsionsgröße sowie tendenziell verbesserte Gewebeerhaltung bekräftigt wird. Bei der histologischen Unter-suchung verschiedener Fasertrakte wurde festgestellt, dass lediglich sensorische Afferenzen des Ischiasnervs verstärkt in die Läsionsnarbe eingewachsen sind.
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit zwei funktionell wirksame Ansätze zur Behandlung von akuten Rückenmarksverletzungen. Basierend auf den vorliegenden Daten scheint eine Behandlungsstrategie mit BSA vielversprechender zu sein als mit DFO+SDF-1α. Allerdings deuten die Ergebnisse ebenso an, dass das Optimum von DFO und SDF-1α hier nicht erreicht wurde. Weitere Untersuchungen zu Dosierung und Behandlungszeitraum werden darüber Aufschluss geben können. Des Weiteren sollte in zukünftigen Studien beider Ansätze der Aspekt der spinalen Plastizität thematisiert werden, um Aufschluss über den zugrundeliegenden Mechanismus der beobachteten funktionellen Erholung zu erhalten.

Traumatic injuries of the spinal cord result in the formation of a collagenous fibrous scar in the lesion centre. Characterised by a dense extracellular matrix network, which accumulates a variety of growth-inhibitory molecules, the fibrous scar is regarded as a barrier for regenerating axons. Previously, our group has developed an anti-scarring treatment (AST), consisting of the injection of the iron chelator 2,2'-bipyridine-5,5'-dicarboxylic acid (BPY-DCA) to inhibit the enzyme prolyl-4-hydroxylase and 8-bromoadenosine 3',5'-cyclic monophosphate (8-Br-cAMP) to inhibit CTGF expression into the injured spinal cord. AST transiently suppressed fibrous scar formation and promoted axonal regeneration through the lesion site as well as partial improvements of motor functions. Despite these promising results, a medical application in humans is very unlikely due to the chelator-solvent Tris and the method of application, which includes injections into the intact spinal cord. In this study, the injection protocol has been replaced by intrathecal catheter infusion, which is widely accepted in clinical use, and which has been connected to an osmotic minipump, that allows continuous drug infusion. Due to the very narrow subdural and subarachnoid space in rats, chronic intrathecal tubing is often discussed to induce extensive scarring and compressions in the rat spinal cord. In this work, an intrathecal catheter application method is presented that allows unrestricted intrathecal drug infusion over a period of at least two weeks without provoking further damage to the spinal cord. In comparison to BPY-DCA, the potency of the iron chelators 2,2'-bipyridine (BPY) and deferoxamine mesylate (DFO) to reduce collagenous scarring was investigated after a dorsal hemisection at thoracic level Th8. The quantification of the Coll IV pixel percentage in the scar area revealed that all three iron chelators, intrathecally infused for 7 days, were able to reduce collagenous scarring significantly. In previous studies addressing the local AST injection, however, a combination with 8-Br-cAMP was indispensable for effective collagen reduction. Since DFO shows a higher potential in reducing the collagenous scar than BPY and has additionally the advantage of being an approved drug, DFO has been selected for further studies. Moreover, DFO can also be applied systemically. A comparison between intrathecal DFO infusion and daily systemic (i.p.) DFO injections for 14 days showed that systemically applied DFO was just as effective in reducing collagenous scarring as intrathecally infused DFO. Further, the quantitative analysis of the blood vessel density in the scar area confirmed DFO`s potential to promote angiogenesis. However, the investigation of functional regeneration over a period of 16 weeks revealed that a 2-week intrathecal infusion of DFO in spinal cord injured rats is ineffective to induce long-lasting functional recovery. As moderate functional improvements were seen in the early phase of behavioural testing, it indicates that DFO has regenerative potential but probably longer treatment periods are necessary to promote long-lasting functional recovery. Furthermore, there was no evidence of axonal regeneration through the lesion site. Only a trend towards reduced lesion size and improved tissue preservation has been found in DFO-treated animals. Due to the generally limited axon regeneration in the adult CNS, DFO was combined in an additional group with the chemokine stromal cell-derived factor 1α (SDF-1α/CXCL12), which is known to stimulate axonal sprouting. In contrast to the modest effect of DFO or SDF alone on locomotor recovery, simultaneous treatment with DFO and SDF-1α induced significant long-term regeneration of skilled walking. Normal overground locomotion evaluated by gait analysis was, however, not improved by the treatment. In addition, histological analyses revealed that DFO+SDF-1α improves neither tissue protection nor regeneration of CST axons, but it enhanced axon densities of ascending sensory fibres in the lesion scar, which may have contributed to the observed functional improvements. The most surprising finding of this study was that BSA, which was included as vehicle control for SDF-1α, seems to have a more potent effect on functional recovery than DFO and SDF-1α together. In all functional analyses (except BBB), BSA treatment resulted in the largest functional recovery, which was already evident from the very first moment of post-injury testing. An early onset of functional recovery is indicative for a neuroprotective function of BSA, which was supported by significantly reduced lesion areas and a tendency towards better tissue preservation in BSA-treated animals. Furthermore, the histological investigation of different fibre populations showed that BSA treatment enhanced only axon ingrowth of sensory sciatic afferents into the lesion scar.
In summary, the present thesis identifies two functionally effective treatment approaches for acute spinal cord injury. Based on the existing data, BSA treatment seems to be more promising than DFO+SDF-1α. However, the results also indicate, that the best treatment condition of DFO and SDF-1α has not been reached. Further investigations on dosage and treatment duration will clarify whether the observed functional recovery can still be improved. Furthermore, the aspect of spinal plasticity should be addressed in future studies to examine the contribution of axonal sprouting in the observed functional recovery.
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Neurobiologie
Dokument erstellt am:30.10.2014
Dateien geändert am:30.10.2014
Promotionsantrag am:15.07.2014
Datum der Promotion:23.09.2014
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