Dokument: Physiologie und Biotechnologie des Lectins B aus Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Physiologie und Biotechnologie des Lectins B aus Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3119
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050612-001119-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Tielker, Denis [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,20 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter]
Stichwörter:	Pseudomonas, aeruginosa, Lectin, Lektin, Biofilm, Adhäsion, LecB, PA-IIL, LecA, PA-IL PATENT -> erst in einem Jahr freischalten
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Das fakultativ pathogene Bakterium Pseudomonas aeruginosa ist Auslöser einer Vielzahl verschiedenster Infektionen, insbesondere des respiratorischen Traktes von Patienten, die unter cystischer Fibrose leiden. Zusätzlich zur hohen intrinsischen Resistenz gegenüber vielen der gängigen Antibiotika wird die Behandlung von P. aeruginosa-induzierten Infektionen durch die Formation von Biofilmen auf dem betroffenen Gewebe erschwert. Zum pathogenen Potential des Bakteriums tragen diverse Virulenzfaktoren bei. Darunter befinden sich die beiden Lectine LecA (alternativ PA-IL) und LecB (alternativ PA-IIL), die eine natürliche Affinität zu D-Galactose bzw. L-Fucose und D-Mannose aufweisen und diverse cytotoxische Effekte gegenüber Zellen des respiratorischen Epithels auslösen. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die physiologische Charakterisierung des LecB-Proteins im Hinblick auf das pathogene sowie biotechnologische Potential dieses Lectins. (1) Nach der heterologen Überexpression des lecB-Gens in Escherichia coli erfolgte die affinitätschromatographische Reinigung des Lectins unter Ausnutzung der intrinsischen Affinität zu D-Mannose. Die Aktivität des rekombinanten LecB-Proteins konnte in Hämagglutinationstests an Kaninchen-Erythrozyten nachgewiesen werden. Das gereinigte Lectin wurde anschließend u. a. erfolgreich zur Aufklärung der Proteinstruktur eingesetzt. (2) Durch die Deletion der Gene lecA und lecB wurden Lectin-negative Stämme von P. aeruginosa konstruiert, um den Einfluss der Lectine auf den Prozess der Biofilmbildung zu untersuchen. Ausgehend von diesen Stämmen wurde zusätzlich eine Doppelmutante erzeugt, die eine Defizienz in beiden Lectin-Genen aufweist. Die Fähigkeit zur Biofilmbildung dieser Stämme wurde unter statischen und dynamischen Kulturbedingungen mittels konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) analysiert. Die Untersuchungen ergaben, dass das LecB-Protein zur Ausbildung von Biofilmen beiträgt, da der LecB-negative Stamm im Vergleich zum Wildtyp in diesem Prozess signifikant beeinträchtigt war. Dabei war der Einfluss des Lectins auf die Biofilmbildung unter statischen Bedingungen ausgeprägter als im dynamischen Modell. Aufgrund der Beobachtungen wird angenommen, dass das Lectin durch multivalente Wechselwirkungen mit Polysacchariden der extrazellulären, polymeren Substanzen maßgeblich zur Organisation der Biofilmmatrix beiträgt. (3) Anlässlich des beobachteten Einflusses des LecB-Proteins auf den Prozess der Biofilmbildung und der verschiedenen cytotoxischen Effekte des Lectins gegenüber respiratorischen Epithelzellen sollte die subzelluläre Lokalisation des Lectins aufgeklärt werden. Dazu wurden planktonische sowie sessile Zellen von P. aeruginosa fraktioniert und das LecB-Protein in den einzelnen Zellkompartimenten immunologisch lokalisiert. Das Lectin konnte sowohl im Cytoplasma als auch in der äußeren Membran der Bakterien nachgewiesen werden. Ferner wurde gezeigt, dass die Assoziation des Lectins mit der äußeren Zellmembran auf der Interaktion mit LecB-spezifischen Glycostrukturen beruht. Die Präsenz potentieller Rezeptoren auf der bakteriellen Zelloberfläche konnte unter Verwendung einer fluoreszenzmarkierten LecB-Variante mittels CLSM dokumentiert werden. (4) Wie gezeigt wurde, ist ein erheblicher Anteil des LecB-Proteins mit der äußeren Membran von P. aeruginosa assoziiert. Dabei weist das Lectin keines der derzeit bekannten N-terminalen Sekretionssignale auf. In Homologie zum Sekretionsmotiv einer Nukleosid Diphosphat Kinase aus P. aeruginosa beinhaltet das LecB-Protein in der Nähe des C-Terminus ein D-A-V-V-Tetrapeptid. Durch die immunologische, subzelluläre Lokalisierung einer mutierten LecB-Variante, in der die Sequenz dieses putativen Sekretionsmotivs gegen vier Alanine ausgetauscht wurde, konnte der Einfluss des Tetrapeptids auf die LecB-Sekretion belegt werden. Analysen der Struktur-Funktions-Beziehung ergaben, dass das Motiv mit der Ca2+-abhängigen Zuckerbindestelle des Lectins überlappt. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, ob das D-A-V-V-Tetrapeptid, ähnlich dem C-terminalen Signal von Typ I-Substraten, ein „echtes“ Sekretionsmotiv darstellt oder ob vielmehr die Fähigkeit zur Zuckerbindung eine essentielle Voraussetzung für die Translokation des Proteins in die äußere Membran ist. (5) Zudem konnte gezeigt werden, dass das LecB-Protein unter Ausnutzung der intrinsischen Affinität zu D-Mannose als Affinitäts-tag für die effiziente Ein-Schritt-Reinigung rekombinanter Proteine eingesetzt werden kann. Dazu wurden verschiedene Modellproteine mit dem Lectin fusioniert und nach der Produktion in E. coli in einem einzigen chromatographischen Schritt mittels D-Mannose-Agarose aus dem Rohextrakt isoliert. Darüber hinaus wurde das LecB-Protein erfolgreich als linker für die spezifische, nicht-kovalente Immobilisierung einer Lipase aus Bacillus subtilis an eine L-Fucose-Agarosematrix eingesetzt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	12.06.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	10.06.2005
Datum der Promotion:	10.06.2005