Dokument: Biophysical characterization of the N-terminal region of Dengue virus NS4A protein

Titel:	Biophysical characterization of the N-terminal region of Dengue virus NS4A protein
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30922
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20141016-093853-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Hung, Yu -Fu [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,72 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.10.2014 / geändert 10.10.2014
Beitragender:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Denguevirus (DENV) besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom in Plusstrangorientierung und gehört zur Familie der Flaviviridae. Dengueviren werden durch den Stich einer infizierten Mücke auf den Menschen übertragen und sind Auslöser von Denguefieber, aktuell der Tropenkrankheit mit der rasantesten Ausbreitung weltweit. Obwohl gefährliche Verläufe der Krankheit lebensbedrohend sind, stehen bislang weder eine Schutzimpfung noch antivirale Medikamente gegen Dengueviren zur Verfügung. Ein wichtiger Schritt im viralen Lebenszyklus ist die Vervielfältigung des viralen RNA Genoms. Dies erfolgt bei DENV in spezialisierten Replikationskomplexen (RCs) innerhalb umgestülpter Membranvesikel des endoplasmatischen Retikulums (ERs), wobei dieser Vorgang bislang nur teilweise verstanden ist. Das DENV Nichtstrukturprotein 4A (NS4A) ist ein im ER lokalisiertes, integrales Membranprotein. Es besitzt eine konservierte, im Zytoplasma lokalisierte, aminoterminale Region sowie zwei Transmembrandomänen, welche durch eine membranassoziierte und im ER-Lumen lokalisierte Domäne miteinander verbunden sind. Es weist vieles darauf hin, dass NS4A eine wichtige Rolle bei der Entstehung der viralen Replikationsfabriken spielt. NS4A scheint Membranänderungen hervorrufen zu können und könnte somit an der Ausbildung der Membranvesikel beteiligt sein. Kürzlich wurde mittels Sekundärstrukturvorhersage gezeigt, dass die konservierte, aminoterminale Region von NS4A eine amphipathische Helix (AH) ausbilden könnte. Mutationsstudien mit dem Ziel, den vorhergesagten amphipathischen Charakter dieser Region zu zerstören, zeigten, dass diese NS4A Region kritisch für die Replikation ist. Diese Doktorarbeit basiert auf der Hypothese, dass sich in der aminoterminalen Region von NS4A, also innerhalb der Aminosäurepositionen 1 bis 48, Strukturelemente ausbilden, die essentiell für die Replikationsfähigkeit von DENV sind. Es wurde die Struktur von NS4A(1-48) mit Hilfe der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR) sowohl in Ab- als auch in Anwesenheit von Modellmembranen analysiert. Zur Untersuchung der Wechselwirkung von NS4A(1-48) mit Lipiddoppelschichtmembranen wurden biophysikalische Techniken eingesetzt, wobei ebenfalls eine replikationsdefiziente Mutante NS4A(1-48, L6E;M10E) analysiert wurde. Die NMR-basierte Strukturaufklärung setzt das Vorhandensein (15N, 13C)-isotopenmarkierter Peptide im Milligramm-Maßstab voraus. Es wurde ein einheitliches Expressions- und Reinigungsprotokoll für beide Peptide etabliert, welches die Verwendung eines dualen Fusionsanhanges sowie dessen proteolytische Abtrennung mittels Tobacco Etch Virus Protease beinhaltet. So konnten 4 bis 5 mg der Peptide, welche keinerlei artifiziellen Überhang aufweisen, pro Liter Kulturmedium gewonnen werden. Dass sowohl NS4A(1-48) als auch NS4A(1-48, L6E;M10E) in wässriger Lösung unstrukturiert vorliegen, konnte mittels Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie gezeigt werden. Die Zugabe von Modellmembranen wie DPC-, SDS- oder CTAB-Mizellen induziert die Ausbildung einer α-helikalen Konformation in unterschiedlicher Ausprägung in beiden Peptiden. NMR-Daten, wie die chemischen Verschiebungen des Peptidrückgrates, wurden für eine detaillierte Analyse der Sekundärstruktur beider Peptide herangezogen. Nach Zugabe von Detergenz-Mizellen änderten sich die chemischen Verschiebungen sowohl bei NS4A(1-48) als auch bei der Mutante, was auf die Ausbildung α-helikaler Strukturen in SDS-Mizellen hindeutet. Die Position und die Länge der α-Helices sind in beiden Peptiden sehr ähnlich, mit einer kurzen, 6 Reste umfassenden Helix und einer darauf folgenden längeren Helix, die 15 Reste umfasst. Die eingeführten Mutationen verringern dabei die Auftrittswahrscheinlichkeit der ersten, kürzeren Helix um etwa 10%. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Messungen zeigten, dass NS4A(1-48) und NS4A(1-48, L6E;M10E) unterschiedliche Membranbindungseigenschaften aufweisen. Während NS4A(1-48) eine deutlich ausgeprägte Bindung an Lipiddoppelschichten verschiedener Zusammensetzungen zeigt, bindet die Mutante möglicherweise nur unspezifisch und deutlich schwächer. Dengue virus (DENV) is a mosquito-transmitted positive single strand RNA virus of the Flaviviridae family. DENV is the causative agent of dengue fever, currently the world's fastest-spreading tropical disease. There is an urgent need for the development of a specific treatment and anti-DENV vaccines, because severe forms of the disease are life threatening. One crucial step in the viral life cycle is the amplification of the viral RNA genome in specialized replication complexes (RCs) that are localized inside invaginated membrane vesicles at the endoplasmatic reticulum (ER). However, up to now the details of RC formation are incompletely understood. The DENV non-structural protein 4A (NS4A) is an integral ER-resident protein that consists of a conserved, cytoplasm-exposed amino terminal region, two transmembrane (TM) domains and one membrane-associated, ER-lumen facing domain that links the two TM segments. NS4A was proposed to be a key player in the formation of the DENV replication factories. NS4A was suggested to mediate membrane alterations and hence may promote membrane vesicle formation. Recently, conserved putative amphipathic helix (AH) forming amino acid sequences had been identified inside the cytoplasmic amino terminal region of NS4A by secondary structure prediction. Mutations designed to disrupt the amphipathic nature of this region showed that this part of NS4A is critical for viral replication. This thesis is based on the hypothesis that the amino terminal region of NS4A, i.e., amino acid residues 1-48, contains structural elements that are essential for DENV replication. The structure of NS4A(1-48) was studied by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy both in presence and absence of model membranes. Biophysical techniques were used to probe the interaction between NS4A(1-48) and lipid bilayer membranes. In addition, the mutated peptide NS4A(1-48, L6E;M10E) was studied. These two point mutations of NS4A are sufficient to render DENV replication deficient. NMR-based structure determination requires milligram amounts of (15N, 13C) isotope-labeled peptide. A new procedure for recombinant expression and purification of the two NS4A peptides was established. The peptides were expressed as a fusion with a dual tag. Tobacco etch virus protease mediated cleavage generated the NS4A peptides without any artificial overhang. A final yield of about 4 to 5 milligrams peptide per liter of culture medium was obtained. Circular dichroism (CD) data revealed that both NS4A(1-48) and NS4A(1-48, L6E;M10E) are unstructured in aqueous buffer. However, addition of membrane mimicking DPC, SDS, or CTAB detergent micelles induced various degrees of α-helical conformation in wild type and mutant NS4A(1-48). A detailed analysis of the secondary structure of both peptides was conducted on the basis of NMR backbone chemical shift data. Chemical shifts of both wild type and mutant peptide changed significantly upon addition of detergent micelles and indicated α-helix formation in SDS micelles. Position and length of the α-helices are very similar in both peptides, with a short helix of 6 amino acids in front of a longer helix containing 15 amino acids. The mutations reduce the helix propensity of the short, N-terminal helix by ~10%. In SPR measurements NS4A(1-48) and NS4A(1-48, L6E;M10E) show different membrane binding characteristics. NS4A(1-48) showed more pronounced binding to lipid bilayers of various compositions, while the mutant peptide displayed only weak, presumably unspecific binding
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	16.10.2014
Dateien geändert am:	16.10.2014
Promotionsantrag am:	02.10.2014
Datum der Promotion:	15.10.2014