Dokument: Charakterisierung der Adhäsionsstabilität αIIbβ3-exprimierender HEK293 Zellen an immobilisierte Adhäsivproteine (Fibrinogen und von-Willebrand-Faktor)

Titel:	Charakterisierung der Adhäsionsstabilität αIIbβ3-exprimierender HEK293 Zellen an immobilisierte Adhäsivproteine (Fibrinogen und von-Willebrand-Faktor)
Weiterer Titel:	Characterization of the adhesion of αIIbβ3-expressing HEK293 cells to immobilized adhesive proteins (fibrinogen and van-Willebrand-factor)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30748
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140925-145324-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kunstreich, Marina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,49 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.09.2014 / geändert 25.09.2014
Beitragende:	Prof. Dr. med. Scharf, Rüdiger E. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. med. Hohlfeld, Thomas [Gutachter]
Stichwörter:	displacement, integrins, Leu33Pro, platelets, vWF, fibrinogen, shear force
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	αIIbβ3, ein polymorpher thrombozytärer Integrinrezeptor, spielt eine zentrale Rolle bei der Plättchenadhäsion, Plättchenaggregation, Plättchenthrombusbildung und Thrombusstabilität. Der HPA-1-Polymorphismus ist durch eine Punktmutation mit einem Aminosäureaustausch in Position 33 der β3-Untereinheit des Integrins gekennzeichnet. Die resultierenden Isoformen tragen entweder Leucin (HPA-1a, Leu33) oder Prolin (HPA-1b, Pro33). Klinische Assoziationsstudien lassen darauf schließen, dass das HPA-1b-Allel eine kritische Rezeptorvariante darstellt. So konnte von unserer Arbeitsgruppe belegt werden, dass Patienten mit koronarer Herzkrankheit (KHK), die Träger des HPA-1b-Allels sind, im Median 5 Jahre früher einen Myokardinfarkt erleiden als HPA-1b-negative KHK-Patienten (Zotz et al, 2005). Dieses Ergebnis hat zu der Hypothese geführt, dass die HPA-1b (Pro33)-Variante des Integrins αIIbβ3 eine erhöhte Plättchenthrombogenität bedingt. Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Einfluss des HPA-1b-Allels auf die Adhäsionsaktivität und -stabilität des Integrinrezeptors αIIbβ3 gegenüber immobilisiertem Fibrinogen (Fg) oder von-Willebrand-Faktor (vWF) unter flussdynamischen Bedingungen an einem Zellmodell zu untersuchen. Hierzu wurden αIIbβ3-transfektierte und fluoreszenzmarkierte HEK293-Zellen eingesetzt, die stabil entweder die HPA-1a (Leu33)- oder die HPA-1b (Pro33)-Isoform des Integrins exprimierten. Die Versuche wurden in einer Flusskammer durchgeführt. Die Deckgläser wurden mit Fg (Konzentration: 50 oder 100 μg/ml) , vWF (Aktivität vWF:RCo 50 oder 100%) oder 1% BSA (Kontrolle) beschichtet. Für nachfolgende Experimente dienten sog. „Displacement“-Bedingungen. Hierzu wurden die transfektierten HEK293-Zellen zunächst bei venösen wandnahen Scherraten (30 s-1) zur Adhäsion an Fg oder vWF gebracht, nachfolgend stufenweise steigenden Scherraten (bis maximal 2000 s-1) exponiert und schließlich die Raten residueller, also noch adhärenter HEK-Zellen mittels digitaler Bildgebung fortlaufend bestimmt. Die HPA-1b-Isoform αIIbβ3-transfektierter HEK-Zellen wies bei Exposition arterieller Scherraten (2000 s-1) eine signifikant höhere Adhäsionsstabilität an immobilisiertes Fg als die HPA-1a-Isoform auf (p<0.05). So betrug die Rate residueller adhärenter HPA-1b-Zellen bei einer Fg-Konzentration von 50 bzw. 100 μg 87 ± 8% (MW + SD) bzw. 95 ± 6%, die residueller adhärenter HPA-1a-Zellen hingegen 62 ± 15% bzw. 57 ± 15%. In dem getesteten Bereich hatte die Höhe der Fg-Konzentration also keinen Einfluss auf die Adhäsionsaktivität der transfektierten HEK-Zellen. Ein grundsätzlich anderes Adhäsionsprofil der Transfektanten zeigte sich gegenüber immobilisiertem vWF. Bereits bei Applikation venöser Scherraten (bis 500 s-1) fiel die Rate noch adhärierender HEK293-Zellen beider Isotypen signifikant ab (p<0.05). Wurden die Scherraten stufenweise weiter erhöht (bis 2000 s-1) lag der Prozentsatz residueller adhärenter HPA-1a-Zellen mit 45 ± 9% über dem der HPA-1b-Zellen (32 ± 5%)(p<0.05). Die Konzentration bzw. Aktivität des immobilisierten vWF war in den getesteten Bereichen wiederum ohne Einfluss. Die Ergebnisse demonstrieren, 1) dass die Art des Adhäsivproteins die Adhäsions- stabilität transfektierter αIIbβ3-HEK-Zellen an immobilisierte Liganden maßgeblich beeinflusst und 2) dass die HPA-1b (Pro33)-Variante von αIIbβ3 bei der Interaktion mit immobilisiertem Fg tatsächlich prothrombotische Eigenschaften besitzt . Hingegen zeigt die HPA-1a (Leu33)- Variante von αIIbβ3 bei immobilisiertem vWF eine höhere Adhäsionsstabilität als die HPA-1b (Pro33)-Variante. Integrin αIIbβ3 plays a major role in platelet adhesion, aggregation and thrombus stability. The molecular basis of the αIIbβ3 polymorphism HPA-1 is a 1565T-C transition in exon 2 of the ITGB3 gene and resulting to an amino acid exchange from Leu33 (HPA-1a) to Pro33 (HPA-1b). The aim of this study was to compare the adhesion characteristic of HPA-1a and HPA-1b to the immobilized ligands fibrinogen and vWF. Transfected and fluorescently tagged HEK293 cells stably expressing either Leu33 or Pro33 variant of αIIbβ3 were generated. Clones expressing equal copy numbers of αIIbβ3 on the surface were used in an established flow model coated coverslips with either Fg or vWF. After every shear-rate increasing step, the proprtion of residual cells was quantified by digital imaging. Onto immobilized fibrinogen (50 mg/ml) we observed at a shear rate of 2000s-1 the proportion of residual HPA-1b still adherent was 86.75 ± 7.8% (mean±SD), while 61,49 ± 15,31% of HPA-1a cells were adherent (p<0.05). By contrast, the proportion of adherent Leu 33 cells was significantly higher at shear rates of 60s-1 to 2000s-1 using vWF compared to Pro 33 cells. Corresponding results were observed onto vWF:Rco 50%. Our findings demonstrate that the type of adhesive protein can alter the resistance to shear of adherent HEK293 cells expressing either isoform of αIIbβ3 (HPA-1a or HPA-1b). On immobilized fibrinogen, HPA-1b cells are significantly more resistant to shear. On immobilized vWF, HPA-1a cells are significantly more resistant to shear.
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Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	Beginn der Dissertation November 2010 Abschluss der Dissertation Juli 2014
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	25.09.2014
Dateien geändert am:	25.09.2014
Promotionsantrag am:	30.04.2013
Datum der Promotion:	15.07.2014