| Beschreibungen: | In den letzten Jahren wurden große Fortschritte erzielt die molekularen Mechanismen des Alterns von Zellen und Organismen zu verstehen. Dabei wurde evident, dass in diesen Mechanismen unterschiedliche Klassen von Biomolekülen involviert sind. Ziel dieser Arbeit ist es die Rolle der Proteine in der stromalen Alterung zu untersuchen und einen Beitrag zur Aufklärung des stromalen Alterungsprozesses zu leisten sowie die Mechanismen des Alterns zu ergänzen. Um eine komplexe Mischung von Proteinen quantitativ mittels Massenspektrometrie untersuchen zu können, wurden zunächst methodische Arbeiten durchgeführt. Infolge der Verfügbarkeit unterschiedlicher Massenspektrometer stellte sich die Frage, welches für das geplante Experiment in Hinsicht auf Sensitivität und Genauigkeit am geeignetsten ist. Aufgrund der signifikant höheren Detektionsrate von b-Ionen und auch y-Ionen und der daraus resultierenden gesteigerten Identifizierungsrate von Proteinen wurde ein Orbitrap-Massenspektrometer für die Analyse humaner Zellen ausgewählt. Nachfolgend wurde ein Arbeitsablauf für die labelfreie Quantifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie etabliert. Im Anschluss wurde ein zelluläres ex vivo Hautalterungsmodell unter Verwendung in situ gealterter primärer adulter humaner dermaler Fibroblasten, als Hauptzelltyp des Stromas, von 15 verschiedenen Individuen mittels labelfreier Proteomanalyse auf Ebene der intrazellulären und sezernierten Proteine untersucht. Ergänzt wurden die Daten durch Arbeiten weiterer molekularer Aspekte, wie Telomerlängen, genomische Stabilität und Analysen der mRNA und miRNA, welche im Rahmen des Verbundprojekts „GerontoSys - stromal ageing“ in Kooperation erstellt wurden. Durch die quantitative Analyse des Proteoms konnten 43 altersabhängig veränderte Proteine identifiziert werden, die einen moderaten altersassoziierten zellulären Phänotyp ausbilden und in acht übergeordnete biologische Prozesse, wie die Differenzierung, die Proliferation, die Proteostase, den RNA-Metabolismus, die Zellkommunikation, die Zellorganisation, den Zellstress und den Zelltod, involviert sind. Der Abgleich mit mRNA -Daten gab Hinweise darauf, dass 77 % dieser Proteine nicht durch die Genexpression reguliert werden. Zudem konnte durch die Berücksichtigung von miRNA-Daten gezeigt werden, dass drei Proteine einer potentiell posttranskriptionalen Regulation durch miRNAs unterliegen. Die meisten der Proteine wurden noch nicht im Rahmen der Alterung von Fibroblasten beschrieben, gleichwohl bestätigen die identifizierten Prozesse die bekannten molekularen Charakteristika des Alterns. Durch die quantitative Analyse des Sekretoms konnten 70 altersabhängig veränderte Proteine identifiziert werden, die in die Organisation der extrazellulären Matrix, die Formation von elastischen Fasern, die Inflammation und die interzelluläre Kommunikation involviert sind. In dieser Arbeit wurde erstmals der altersassoziierte sekretorische Phänotyp dermaler Fibroblasten auf Ebene der Proteine charakterisiert. Durch den Vergleich mit dem in der Literatur beschriebenen seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp wurde gezeigt, dass die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine und Matrix-Metalloproteinasen ein gemeinsamer Aspekt der induzierten Seneszenz und des in situ Alters ist, obgleich die Phänotypen deutliche Unterschiede aufweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben Rückschlüsse auf die intra- und extrazellulären Veränderungen der Fibroblasten während des Alterns zu ziehen und tragen zu einem besseren Verständnis des Alterungsprozesses, der Mechanismen der Hautalterung und der Beteiligung der Fibroblasten an der stromalen Alterung bei.In recent years, great progress has been achieved to understand the molecular mechanisms of cellular and organismal ageing. It became evident that different classes of biomolecules are involved in these mechanisms. The aim of this study is to investigate the role of proteins in stromal ageing and to complement the mechanisms of the ageing process. For quantitative analysis of a complex protein mixture methodological development has been performed first. Due to the availability of different mass spectrometers the question arose, which of them is suitable for the planned experiments in terms of sensitivity and accuracy. Because of the significantly higher detection rate of b-ions and y-ions, and the resulting increased rate of protein identification an Orbitrap mass spectrometer has been selected for the analysis of human cells. Subsequently, a label-free mass spectrometric workflow for quantification of proteins was established. Next, the intracellular and secreted proteins of an ex vivo skin ageing model of in situ aged primary adult human dermal fibroblasts, as the major cell type within the stroma, of 15 different individuals were analysed using the established approach. The data were supplemented by analyses of other molecular aspects, such as telomere length, genomic stability, and alterations on mRNA and miRNA level, which were analysed within the research project “GerontoSys – stromal ageing”. Quantitative analysis of the proteome revealed 43 proteins exhibiting an age-associated abundance change, thereby developing a moderate age-associated cellular phenotype. The age-associated proteins are involved in eight biological categories, such as differentiation, proliferation, proteostasis, RNA metabolism, cell communication, cell organisation, response to stress and cell death. Comparing the results obtained from proteomics with mRNA and miRNA data revealed that at least 77 % of altered proteins were not regulated via gene expression, and at least three candidate proteins were potentially post-transcriptionally regulated by miRNAs. Most of the identified proteins have not been described in the context of the fibroblasts’ ageing yet, but the deduced processes confirmed known molecular hallmarks of ageing. Quantitative analysis of secreted proteins revealed 70 proteins exhibiting an age-dependent secretion pattern. The proteins are involved in extracellular matrix organisation, elastic fiber formation, inflammation and intercellular communication. Within this work, the age-associated secretory phenotype of dermal fibroblasts was characterised for the first time at the level of proteins. The comparison of the identified phenotype with the described senescence-associated secretory phenotype revealed that the secretion of pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinases are common aspects of induced senescence as well as in situ ageing. Furthermore, the comparison revealed that the secretory phenotype of in situ aged human dermal fibroblasts significantly differs from the senescence-associated secretory phenotype. The results of this work allow a comprehensive insight into the intra- and extracellular alterations of fibroblasts during in vivo ageing. In addition, they contribute to a better understanding of the mechanisms of the ageing process and the involvement of fibroblasts in stromal ageing.
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