Dokument: Heterologe Proteinsekretion von Candida utilis

Titel:	Heterologe Proteinsekretion von Candida utilis
Weiterer Titel:	Heterologous protein secretion by Candida utilis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30535
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140911-130148-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bürth, Christoph [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,60 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.09.2014 / geändert 02.09.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Freudl, Roland [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Futterhefe Candida utilis verwertet ein breites Substratspektrum und wächst auch mit Xylose als Kohlenstoffquelle zu hohen Zelldichten. Der bisherige biotechnologische Einsatz von C. utilis beschränkte sich auf die intrazelluläre Herstellung von endo- und exogenen Produkten. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Sekretionssystems für heterologe Proteine in C. utilis, wodurch sowohl eine effektive Sekretion in das Kulturmedium, als auch in die Pilzzellwand in Form einer Oberflächenpräsentation erreicht werden sollte. Die massenspektrometrische Analyse des natürlichen Sekretoms von C. utilis zeigte die ausgeprägte Sekretionsfähigkeit dieser Hefe. Im Kulturmedium wurden 37 Proteine identifiziert, von denen N-glykosylierte Invertase eines der Hauptproteine war. Weiterhin stellt die Abwesenheit von Proteasen im Sekretom eine günstige Voraussetzung für die Verwendung von C. utilis als Sekretionswirt dar. Zur Etablierung und Optimierung der heterologen Proteinsekretion wurde die Lipase CalB aus Candida antarctica als Modellprotein eingesetzt. Verschiedene Expressionsvektoren für CALB wurden konstruiert und durch integrative Transformation in das C. utilis-Genom inseriert. Unter Kontrolle von C. utilis-Promotoren wurde die CALB-Expression und eine effektive Sekretion von N-glykosylierter, enzymatisch aktiver CalB in das Kulturmedium erreicht. Optimierungsversuche ergaben, dass der Promotor des glykolytischen TDH3-Gens am effizientesten für die Sekretion der CalB ist. Sekretionsvergleiche von CalB-Varianten, in denen die heterologe CalB-Signalsequenz gegen die heterologe Signalsequenz des Mfα1-Vorläuferproteins aus Saccharomyces cerevisiae oder die homologe Signalsequenz der C. utilis-Invertase ausgetauscht worden waren, zeigten überraschend die höchsten Sekretionswerte für die Mfα1-CalB Fusion. Die Ergebnisse beweisen die Eignung von C. utilis als Sekretionswirt, zeigen aber auch weitere Verbesserungsmöglichkeiten zur Erhöhung der homologen Integration und Stabilität der Expressionsplasmide auf. Um die Oberflächenpräsentation eines heterologen Proteins bei C. utilis zu zeigen, wurden Expressionsvektoren konstruiert, die für die Fusion des C. utilis Gas1-Zellwandproteins an CalB oder β-Galaktosidase kodieren. In Transformanten waren beide Enzyme in aktiver Form an die Zelloberfläche gebunden. In einem weiteren Versuchsansatz wurde ein antigenes Epitop in Form einer Gas1-Fusion auf der C. utilis-Zelloberfläche präsentiert. Durch Fütterung mit Antigen-präsentierenden C. utilis-Zellen wurde in einem Mausmodell eine korrespondierende Immunantwort ausgelöst. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass in Zukunft lebende C. utilis-Zellen als essbare Vakzine oder zur Modulation der Immunantwort eingesetzt werden können. The fodder yeast Candida utilis is able to use broad spectrum of substrates and also grows to high cell densities using xylose as the single carbon source. Previously, the biotechnological use of C. utilis was limited to the intracellular production of endo- and exogenous products. The aim of this thesis was to establish a secretion system for heterologous proteins in C. utilis attempting to achieve efficient secretion into the culture medium and into the fungal cell wall leading to a surface display. Mass spectrometric analysis of the natural secretome of C. utilis demonstrated the high secretion potential of this yeast. In the culture medium 37 proteins were identified, among which N-glycosylated Invertase was one of the most abundant proteins. In addition, absence of proteases in the secretome is advantageous for the use of C. utilis as a secretion host. To establish and optimize heterologous protein secretion the lipase CalB of Candida antarctica was used as a model enzyme. Different expression vectors for CALB were constructed and inserted into the C. utilis genome by integrative transformation. Under control of C. utilis promoters, CALB expression and effective secretion of N-glycosylated and enzymatically active CalB into the culture medium was achieved. Optimization experiments showed that the promoter of the glycolytic TDH3-gene is the most efficient promoter for secretion of CalB. Secretion comparisons of CalB variants, in which the heterologous CalB signal sequence was replaced by the heterologous signal sequence of the Mfα1-precursor protein of Saccharomyces cerevisiae or the homologous signal sequence of the C. utilis invertase, surprisingly revealed highest secretion levels for the Mfα1-CalB fusion. These results prove the suitability of C. utilis as an expression host, but also suggest further improvements to increase the homologous integration and stability of the expression plasmids. To present heterologous proteins on the cell surface of C. utilis, expression vectors were constructed, which encode for the fusion of the C. utilis Gas1 cell wall protein to CalB or β-galactosidase. In transformants both enzymes were bound to the fungal cell surface in an active form. In another approach an antigenic epitope was linked to the cell surface of C. utilis using a fusion to Gas1. Feeding with antigen-presenting C. utilis cells led to a corresponding immune response in a mouse model. This result suggests that live C. utilis cells may be used in the future as an oral vaccine or to modulate immune responses.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	11.09.2014
Dateien geändert am:	11.09.2014
Promotionsantrag am:	03.12.2013
Datum der Promotion:	27.01.2014