Dokument: Multiparameter-Fluoreszenz-Image-Spektroskopie von Proteinkomplexen in planta

Titel:	Multiparameter-Fluoreszenz-Image-Spektroskopie von Proteinkomplexen in planta
Weiterer Titel:	Multiparameter Fluorescence Image Spectroscopy of protein complexes in planta
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30399
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140821-132234-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Grabowski, Stephanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 17,00 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.08.2014 / geändert 21.08.2014
Stichwörter:	Fluoreszenz-Spektroskopie, Mikroskopie, FRET, Fluoreszenz-Anisotropie, FCS, CLAVATA, ACR4, live cell imaging, Komplexbildung von Proteinen, fluoreszente Proteine, GFP
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 530 Physik
Beschreibungen:	Die Multiparameter-Fluoreszenz-Image-Spektroskopie (MFIS) vereinigt folgende Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden: Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (FLIM) und Fluoreszenz-Anisotropie-Mikroskopie (FAIM), mit denen molekulare Komplexbildung über Förster Resonanzenergietransfer (FRET) nachwiesen werden können, sowie Methoden der kinetischen Mikroskopie wie Fluoreszenzerholung nach Photobleichen (FRAP) und Fluoreszenz- Korrelations-Spektoskopie (FCS), mit denen Moleküldynamiken gemessen werden können. In dieser Arbeit wurde erstmalig das volle Potential von MFIS in lebenden Zellen genutzt und die Interaktion der Rezeptorkinasen ACR4 und CLV1, denen eine zentrale Rolle bei der Stammzellenregulation in der Wurzel von Arabidopsis thaliana zukommt, auf molekularer Ebene in planta untersucht. Das simultane Auslesen mehrerer Fluoreszenz-Parameter und die damit verbundene Verknüpfung von Informationen erlaubte die umfassende Untersuchung der molekularen Interaktionen von ACR4 und CLV1, die sowohl Komplexbildung als auch die molekularen Dynamiken umfasst. Komplexbildung von Rezeptorkinasen mit Korezeptoren und Proteinen in der Plasmamembran stellt ein grundlegendes Element der ligandeninduzierten Signaltransduktion dar. In dieser Arbeit wurde sowohl die heteromere als auch homomere Komplexbildung von ACR4 und CLV1 nachgewiesen, die in Fusion mit den fluoreszenten Proteinen GFP und mCherry in Blattepidermiszellen in Nicotiana benthamiana transient exprimiert wurden. FRET-FLIM-Messungen ergaben, dass ACR4 und CLV1 an der Plasmamembran miteinander heteromere Komplexe und jeweils homomere Komplexe bilden. Durch die quantitative Analyse von FRET und die intensitätsbasierte Bestimmung der Molekülkonzentrationen konnte die Gleichgewichtskonstante der Komplexbildung abgeschätzt werden. Die homomere Komplexbildung von ACR4 wurde in stationären und zeitaufgelösten Fluoreszenz-Anisotropie-Messungen über Homo-FRET nachgewiesen. Der kombinierte pixelweise Nachweis von Hetero-FRET über die Fluoreszenz-Lebensdauer und von Homo-FRET über die stationäre Fluoreszenz-Anisotropie in MFIS-Bildern ermöglichte eine Analyse mit hoher räumlicher Auflösung. Auf diese Weise konnten gezielt kleine Kanäle in der Plasmamembran, sogenannte Plasmodesmata (PD), untersucht werden, die bei maximaler Auflösung nur wenige Pixel in einem MFIS-Bild umfassen. Es konnte gezeigt werden, dass an PD eine verstärkte Bildung sowohl von heteromeren Komplexen von ACR4 und CLV1 als auch von homomeren ACR4-Komplexen stattfindet. Molekulare Dynamiken können durch die Kombination von FCS- und FRAP-Messungen auf einer Zeitskala von Mikrosekunden bis Minuten dargestellt werden und beleuchten dabei Membrandomänen von Nano- bis Mikrometern. Während FCS die Diffusion und Komplexbildung einzelner Rezeptoren auf kurzer Längenskala erfasst, kann komplementär mit FRAP die Mobilität größerer Proteinverbände und deren Organisation in Mikrostrukturen der Plasmamembran (PM) gemessen werden. Die Mobilitätsmessungen in dieser Arbeit an ACR4 und CLV1 ergaben, dass beide Rezeptorkinasen in mindenstens drei unterschiedlich mobilen Fraktionen in der PM vorliegen. In Anwesenheit des zugehörigen Liganden zeigte sich eine Zunahme der immobilen Fraktion in Kombination mit abnehmenden Diffusionskoeffizienten der beiden mobilen Fraktionen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass ligandeninduzierte Clusterbildung und verstärkte Assoziation an immobile Membrandomänen ein initiales Element bei der Signalantwort von ACR und CLV1 darstellt. Durch die Detektion und Analyse mehrerer Fluoreszenz-Parameter verknüpfung MFIS Informationen über Energietransfer und Mobilität. Mit MFIS konnte ein differenziertes Bild der molekularen Interaktionen von ACR4 und CLV1 in planta gezeichnet werden, das grundlegende Aspekte der Funktionsweise von Signaltransduktion enthält und in Beziehung setzt. Multiparameter Fluorescence Image Spectroscopy (MFIS) comprises the following fluorescence techniques applied in imaging: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) and Fluorescence-Anisotropy Imaging Microscopy, which are capable of detecting the formation of molecular complexes using Förster Resonance Energy Transfer (FRET), as well as techniques focusing on kinetic properties such as Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), which are applied to determine molecular dynamics. Here, for the first time the whole potential of MFIS was employed in living cells: the interaction of receptor kinases ACR4 and CLV1, which play a central role in stem cell regulation in the root of Arabidopsis thaliana, were investigated on a molecular scale in planta. The simultaneous analysis of different fluorescent parameters and hence, the combination of the resulting information allows for an extensive investigation of the molecular interactions of ACR4 and CLV1, which comprises complex formation as well as molecular dynamics. Complex formation of receptor kinases with co-receptors and proteins of the plasma membrane are a essential element of ligand induced signal transduction. Here, the formation of heteromeric complexes as well as homomeric complexes was studied for ACR4 and CLV1, which were transiently expressed in fusion with the fluorescent proteins GFP and mCherry in Nicotiana benthamiana. In FRET-FLIM experiments heteromeric complex formation of ACR4 and CLV1 as well as formation of homomers of both proteins at the plasma membrane (PM) was detected. Applying a quantitative FRET analysis together with an intensity-based approach to determine molecular concentrations, the equilibrium constant of complex formation could be estimated. The formation of ACR4 homomers was revealed by steady state and time resolved fluorescence anisotropy experiments using homo-FRET. The combined read-out of hetero-FRET determined by fluorescence lifetime and homo-FRET indicated by steady state fluorescence anisotropy in MFIS images facilitated an analysis with high spatial resolution. This approach allowed to specifically investigate small plasma membrane-lined channels, so-called plasmodesmata (PD), which only span a few pixel within an MFIS image at maximum resolution. It was demonstrated that an increased formation of hetero-oligomers of ACR4 and CLV1 as well as homo-oligomers of ACR4 occurs at PD. The combination of FRAP and FCS allows for describing molecular dynamics on a time scale of micro seconds up to several minutes and observing membrane domains on a length scale of nanometers up to micrometers. While FCS covers the diffusion and complex formation of single receptors on a short length scale, FRAP can be applied complementary to investigate mobility of larger protein assemblies and their organization within microstructures of the plasma membrane (PM). The FRAP and FCS measurements on ACR4 and CLV1 carried out here revealed that both receptor kinases are present in the PM in at least three different fractions. In the presence of the respective ligand an increase of the immobile fraction was found. Additionally, a decrease of the diffusion coefficient of both mobile fractions was observed. These results suggest that ligand induced cluster formation and increased association with membrane domains are initial events in signaling of ACR4 and CLV1. The simultaneous detection and analysis of different fluorescent parameters and the subsequent combination of the information regarding energy transfer and mobility allowed for a detailed description of the molecular interactions of ACR4 and CLV1 in planta, covering and connecting fundamental aspects of the functionality of signal transduction.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	2006-2014
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Physikalische Chemie und Elektrochemie
Dokument erstellt am:	21.08.2014
Dateien geändert am:	21.08.2014
Promotionsantrag am:	30.01.2014
Datum der Promotion:	30.01.2014