Dokument: In vitro Liposomen-Rekonstitution intrazellulärer Signaltransduktion kleiner GTPasen

Titel:	In vitro Liposomen-Rekonstitution intrazellulärer Signaltransduktion kleiner GTPasen
Weiterer Titel:	in vitro liposome reconstitution intracellular signaltransduction of small GTPases
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30337
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210819-110111-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr Zhang, Sicai [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,99 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.08.2021 / geändert 19.08.2021
Beitragende:	PD Dr. Reza Ahmadian [Gutachter] Prof. Dr. Johannes Hegemann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die GTPasen der Ras- und Rho-Familien fungieren als molekulare Schalter in der Zelle und regulieren ein breites Spektrum an biochemischen Signalwegen und biologischen Prozessen. Ihre Aktivierung und Deaktivierung werden durch zwei verschiedenen Regulatoren (GEF und GAP) reguliert. Kleine aktive GTPasen ermöglichen die Transduktion von extrazellulären Signalen zu nachgeschalteten Effektoren, in dem sie sich durch posttranslationale Modifikationen, z.B. durch die C-terminale Geranylgeranylierung, an die Plasmamembran anheften. Geranylgeranylierte Rho GTPasen, z.B. Rac1, werden durch einen zusätzlichen Regulator, dem GDI, reguliert. Durch spezifische Bindung an die GDP-gebundene Rho GTPase und die geranylgeranyl-Gruppe veranlasst GDI die Dissoziation der Rac1 von der Plasmamembran. Es wird angenommen, dass die Dissoziation des Rho GTPase-GDI-Komplexes durch p75NTR, ERM Proteine und Phospholipide reguliert wird. Die Rolle dieser so-genannten GDI Displacement-Faktoren (GDF) muss in vitro noch gezeigt werden. Die Ras Keimbahn-Mutationen sind assoziiert mit diversen Entwicklungsstörungen, die auch als RASopathien bezeichnet werden. Detaillierte Analysen einer N-Ras Mutation (T50I) haben weitere Einblicke in die Ras Interaktion mit Membranen gezeigt. Es wird angenommen, dass zwei weitere angrenzende Residuen, D47 und E49, ebenfalls mit der Membran interagieren. Wie sich die Membran Assoziation auf den zellulären Signalweg der N-Ras auswirkt, ist nicht bekannt. In dieser Doktorarbeit wurden Rac1 und N-Ras hinsichtlich ihrer Interaktion mit Lipid-Membranen, Regulatoren und Effektoren unter zellfreien Bedingungen und in Zellen detailliert untersucht. Letzteres ermöglicht uns weitere Einblicke in die Beziehung zwischen Ras-Keimbahn-Mutationen und RASopathien. Es wurde gezeigt, dass das prenylierte Rac1 des Menschen, welche aus Insektenzellen isoliert und gereinigt wurde, mit den Liposomen in einer Nukleotid-unabhängigen Weise interagiert. GDI bindet und extrahiert effektiv Rac1 von den Liposomen, welches in Anwesenheit von Rac1-spezifischen GEFs blockiert wird. Die .Rac1-Aktivierung durch GEFs wirkt sich positiv auf die Regulation von Rac1-Assoziation mit Liposomen aus. Weitere mechanistische Studien haben einen unerwarteten neuen Einblick in die elektrostatische Interaktion zwischen positiv geladener C-Terminus von Rac1 und negativ geladene Regionen terminaler Enden von GDI gezeigt, welche verantwortlich für die Rac1-Extraktion von der Membran sind. Des Weiteren werden die Auswirkungen von diversen Ras-Keimbahn-Mutationen in Detail charakterisiert. Zusammen mit zwei zusätzlichen Mutationen (D47 und E49K) beeinflusst T50I die N-Ras-Interaktion mit der Plasmamembran und sorgt folglich für die Aktivierung der MAPK-Signalweg. Dies deutet darauf hin, dass die Ras-nteraktion mit der Membran durch D47, E49 und T50 höchst wahrscheinlich die Ras-Aktivierung unterdrückt. Demgegenüber stehen zwei K-Ras-Keimbahn-Mutationen, Y71H und K147E, die durch Veränderungen der Effektoren-Interaktionen und Nucleotid-bindenden Eigenschaften zu einem mäßigen Funktionsgewinn (Gain-of-Function) beisteuern. Ein anderer Mutationstyp in R-Ras ist G39dup (Verdopplung von G39). Es wurde gezeigt, dass dieser Mutationstyp höhere MAPK-Signale erzeugt, da grundlegende und GAP-stimulierende GTP-Hydrolyse reduziert werden. Unsere Daten unterstützen die Aussage, dass individuelle Ras Mutationen, obwohl sie mit vielen Phänotypen von Entwicklungsstörungen in Patienten in Zusammenhang stehen, diverse bemerkenswerte biochemische Effekte mit einem gemeinsamen Ergebnis erzielen können, und zwar dem mäßigem Funktionsgewinn (Gain-of-Function). The Ras and Rho family of small GTPases function as a molecular switch in the cell and regulate a spectrum of biochemical pathways and biological processes. Their activation and inactivation are modulated by two distinct regulators, GEF and GAP, respectively. Active small GTPases accomplish transduction of extracellular signal to downstream effectors through anchoring to plasma membrane via posttranslational modification, such as C-terminal geranylgeranylation. Geranylgeranylated Rho GTPases, e.g. Rac1, are modulated by an additional regulator, the GDI, which displaces them from the plasma membrane by specific binding to GDP-bound Rho GTPases and to the geranylgeranyl moiety. The dissociation of the Rho GTPase-GDI complex is thought to be modulated by p75NTR, ERM proteins and phospholipids. The role of such GDI displacement factors (GDF) remains to be demonstrated in vitro. The germline Ras mutations are associated with diverse developmental disorders, collectively referred as RASopathies. Detailed analysis of an N-Ras mutation (T50I) provided novel insights into additional Ras interaction with membrane. Two other adjacent residues, D47 and E49, have been proposed also to interact with the membrane. How such membrane association affects the cellular signaling of N-Ras is still unclear. In this thesis, Rac1 and N-Ras are investigated in details regarding to their interaction with lipid membranes, regulators and effectors under cell-free conditions and in cells. The latter allowed exploring a causal relationship between germline Ras mutations and the RASopathies. We showed that prenylated human Rac1, purified from insect cells interacts with the liposomes in a nucleotide independent manner. GDI efficiently bound to an extracted Rac1 from liposomes, which was blocked in the presence of Rac1-specific GEFs. Rac1 activation by GEFs positively modulated Rac1 association to the liposomes. Further mechanistic studies provided an unexpected new insight for elucidating an electrostatic interaction between the positively charged Rac1 C-terminus and distinct negatively charged regions of the terminal ends of GDI that is responsible for Rac1 extraction from the membrane. Furthermore, the impacts of various germline Ras mutations were characterized in detail. T50I together with two additional mutations (D47K and E49K) clearly affected additional N-Ras interaction with plasma membrane and consequently caused an enhanced activation of the MAPK pathway. These data suggest that Ras interaction with the membrane via D47, E49 and T50 most probably suppresses Ras activation. In contrast, two germline K-Ras mutations, Y71H and K147E, led to mild gain-of-function due to changes of the effector and nucleotide binding properties. Another type of mutation in R-Ras, G39dup (duplication of G39), showed higher MAPK signaling because of reduced intrinsic and GAP-stimuated GTP hydrolysis. Our findings clearly emphasize that individual RAS mutations, despite being associated with comparable phenotypes of developmental disorders in patients, can remarkably cause diverse biochemical effects with a common outcome, namely a rather moderate gain-of-function.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II
Dokument erstellt am:	19.08.2021
Dateien geändert am:	19.08.2021
Promotionsantrag am:	15.08.2013
Datum der Promotion:	07.07.2014