Dokument: Effects of H2O2 signalling originated in chloroplasts and peroxisomes

Titel:	Effects of H2O2 signalling originated in chloroplasts and peroxisomes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30327
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140818-090020-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Jaspert, Nils [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.08.2014 / geändert 14.08.2014
Beitragende:	Maurino, Veronica Graciela [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Zeier, Jürgen [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	H2O2 ist ein Signalmolekül in Eukaryoten, jedoch ist die spezifische Wirksamkeit der Signalwirkung bisher weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit haben wir analysiert, ob eine moderate Produktion von H2O2 in verschiedenen pflanzlichen Zellorganellen divergente Effekte auf das Transkriptom ausübt. A. thaliana Pflanzen, welche die Glycolat Oxidase1 in den Chloroplasten überexprimieren (GO-Pflanzen) und Pflanzen, die einen Funktionsverlust der peroxisomalen catalase2 (cat2 Pflanzen) aufweisen, wuchsen unter nicht-photorespiratorischen Bedingungen an und wurden dann in photorespiratorische Bedingungen transferiert, um die H2O2 Produktion in den Chloroplasten und den Peroxisomen zu induzieren. Durch die Verwendung von existierenden quantitativen real-time PCR (qRT-PCR) Plattformen haben wir zunächst die Antwort von 187 ROS-antwortenden Genen und 1880 Transkriptionsfaktoren (TF) in GO-Pflanzen untersucht. Die Daten legen eine koordinierte Expressionsänderung von Genen eines spezifischen funktionellen Netzwerks, innerhalb von 0,5 Stunden nach Induktion der H2O2 Produktion in den Chloroplasten und Peroxisomen inklusive der Induktion von Indol Glukosinolat und Camalexin Biosynthese Gene, nahe. Die Analyse der TF zeigte eine Hochregulierung der Expression von speziellen entwicklungsbeeinflussenden Genen. Durch die Verwendung von Microarray Analysen, konnten wir zeigen, dass in spezifischen Organellen produziertes H2O2, zwei verschiedene Arten von Antworten induziert: Antworten, die unabhängig vom subzellularen Ort der Produktion agieren und Antworten, welche abhängig vom Ort der Produktion von H2O2 agieren. Während in Peroxisomen produziertes H2O2 Antworten der Protein Reparatur induziert, induziert in den Chloroplasten produziertes H2O2 frühe Signalantworten durch die Kontrolle der Gen Transkription und sekundäre Signal Moleküle. Der Vergleich zwischen cat2 und GO-Pflanzen zeigt, dass H2O2, welches in den Chloroplasten produziert wurde, speziell Gene, welche in der Antwort auf Verwundung und Pathogen Befall involviert sind, wie Camalexin, Indol Glukosinolat und Stigmasterol Biosynthese Gene, induziert. So konnte auch gezeigt werden, dass chloroplastidär produziertes H2O2 die Akkumulation von 4MO-I3M (Glukosinolat) und Stigmasterol induziert. Des Weiteren haben wir die Substratspezifität der peroxisomalen H2O2 produzierenden (L)-2 Hydroxyacid Oxidasen analysiert. Es wurden die Enzymkinetiken von GO1, GO2 und GO3 bestimmt. Die Daten zeigen, dass GO1 und GO2 Glycolat und GO3 Glycolat und L-Laktat als Substrate verwenden können. Um das in vivo Substrat von GO3 bestimmen zu können, wurden Funktionsverlustmutanten der GO3 (go3) isoliert und GO3 Überexpressionslinien generiert. Die Wurzelentwicklung auf MS-Medium, welches Glycolat enthält, zeigte in allen analysierten Genotypen eine negative Beeinflussung. Im Gegensatz dazu, zeigten nur die go3 Linien, auf MS-Medium, welches mit L-Laktat versetzt war, im Vergleich zum Wild Typ kürzere Wurzeln, während die Überexpressionslinien der GO3 im Vergleich zum Wild Typ längere Wurzeln aufwiesen. Als nächstes wurde ein Komplementationsassay in Hefen mit einem Defekt in CYB2, ein L-Laktat metabolisierendes Protein, durchgeführt. Diese Hefen sind nicht in der Lage auf Medium mit L-Laktat als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Die Überexpression von GO3 aus A. thaliana komplementiert diesen Phänotyp, was darauf hinweist, dass L-Laktat das in vivo Substrat von GO3 darstellt. Hydrogen peroxide (H2O2) operates as a signalling molecule in eukaryotes, but the specificity of its signalling capacities remains largely unrevealed. In the present thesis, we analysed whether a moderate production of H2O2 in different organelles of plant cells has divergent effects on the transcriptome. A. thaliana overexpressing glycolate oxidase in the chloroplasts (GO-plants) and plants deficient in peroxisomal catalase (cat2 plants) were grown under non-photorespiratory conditions and then transferred to photorespiratory conditions to induce H2O2 production in chloroplasts and peroxisomes, respectively. By using existing quantitative real-time PCR (qRT-PCR) platforms we first analysed the response of 187 ROS responsive genes and 1880 transcription factors (TF) in GO-plants. Our data revealed coordinated expression changes of genes of specific functional networks 0.5 h after induction of H2O2 production in chloroplasts, including the induction of indole glucosinolate and camalexin biosynthesis genes. The analysis of TF shows an upregulation of expression of genes specifically affecting development. By using microarray analysis we showed that H2O2 originated in specific organelles induces two kinds of responses: one that integrates signals independently from the subcellular site of production and other signals, which are dependent of the H2O2 production site. While H2O2produced in peroxisomes induces protein repair responses, H2O2 produced in chloroplasts induces early signalling responses through the control of gene transcription and secondary signalling messengers. The comparison between cat2 and GO-plants show that genes involved in wounding and pathogen attack response, like camalexin, indole glucosinolates and stigmasterol biosynthetic genes are specifically induced by H2O2 produced in chloroplasts. Indeed, chloroplastic production of H2O2 induces the accumulation of 4MO-I3M and stigmasterol. We further analysed the substrate specificity of peroxisomal H2O2-producing (L)-2 hydrocyacid oxidases. We determined the enzymatic kinetics of GO1, GO2 and GO3. Our data revealed that GO1 and GO2 use glycolate, and GO3 can use glycolate and L-lactate as substrates. To assess the in vivo substrate of GO3, loss-of-function mutants (go3) were isolated and GO3 overexpressing lines were generated. Root development on ½ MS-plates containing glycolate was impaired in all genotypes analysed. In contrast, root development on medium containing L-lactate was impaired in go3 lines with respect to the wild-type, while GO3 overexpressing lines showed longer roots than wild-type. Next a complementation assay in yeast deficient in CYB2, which metabolize L-lactate, was conducted. The deficient yeast is not able to grow on L-lactate as sole carbon source. Overexpression of GO3 from A. thaliana complements this phenotype, strongly suggesting that L-lactate is the in vivo substrate of GO3.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	18.08.2014
Dateien geändert am:	18.08.2014
Promotionsantrag am:	26.04.2014
Datum der Promotion:	26.06.2014