Dokument: Entwicklung von Ganzzellbiokatalysatoren zur Synthese von chiralen Alkoholen

Titel:	Entwicklung von Ganzzellbiokatalysatoren zur Synthese von chiralen Alkoholen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3029
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080108-141252-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Weckbecker, Andrea [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.01.2008 / geändert 08.01.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Braun, Manfred [Gutachter]
Stichwörter:	Chirale Alkohole, Ganzzellbiokatalysatoren, Alkohol-Dehydrogenasen, Coexpression
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Ganzellbiokatalysatoren zur Synthese von chiralen Alkoholen. Es sollten Coexpressionssysteme konstruiert werden, die neben einer NADP-abhängigen (R)-spezifischen Alkohol-Dehydrogenase (ADH) aus Lactobacillus sp. ein Enzym zur Cofaktor-Regenerierung enthalten sollten. Basisenzym für die entwickelten Systeme war eine (R)-spezifische ADH aus Lactobacillus kefir. Anhand der teilweise bekannten Proteinsequenz wurde das adh-Gen isoliert sowie anschließend kloniert und in E. coli-Stämmen exprimiert. Das rekombinante Enzym wurde aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Für die Regenerierung des von der ADH verbrauchten NADPH wurde die substrat-gekoppelte Regenerierung mit Isopropanol als Referenzsystem charakterisiert. Vergleichend dazu wurden verschiedene enzymatische Regenerierungssysteme basierend auf Glucose-Dehydrogenase (GDH) aus Bacillus subtilis, Malic Enzyme (MAE) aus E. coli, Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) aus B. subtilis sowie die gekoppelten Systeme IDH in Verbindung mit Aconitase (AcnB) aus E. coli und NAD-abhängige Formiat-Dehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii in Verbindung mit Pyridin-Nucleotid-Transhydrogenase (PNT) aus E. coli entwickelt. Um die geringe NAD-Nebenaktivität der (R)-ADH auszunutzen, wurde diese mit der FDH gekoppelt. Ein weiteres System wurde entwickelt, indem eine NAD-abhängige Mutante der ADH aus Lactobacillus brevis, Mut2G38D-ADH, mit der FDH kombiniert wurde. Zur Herstellung der Ganzzellbiokatalysatoren wurden ADH und jeweiliges Regenerierungssystem coexprimiert. Nach Expressionsoptimierung der einzelnen Systeme erfolgten die Reinigung der einzelnen Enzyme und die biochemische Charakterisierung von GDH, MAE, IDH und Mut2G38D-ADH. Anhand dieser Daten konnten die Reaktionsbedingungen für Umsetzungen mit gekoppelten Enzymsystemen definiert werden. Nach Tests auf Kreuzreaktionen wurden Umsetzungen im zellfreien System durchgeführt. Anschließend wurden die entwickelten Stämme in Ganzzellbiotransformationen eingesetzt. Als Substrate dienten die prochiralen Ketone Acetophenon, 2,5-Hexandion und 6-Chlor-3,5-dioxohexansäure-tert-butylester. Die erzielten ee- und ggf. de-Werte aller gebildeten Alkohole lagen bei 100 %. Reaktionsansätze mit dem System, das auf der NAD-Nebenaktivität der ADH basiert, zeigten sehr schlechte Umsatzraten. Keines der eingesetzten Substrate konnte vollständig reduziert werden. Das System, das zusätzlich zur ADH und der FDH die PNT enthielt, lieferte bessere Umsatzraten als das Konstrukt, das lediglich ADH und FDH enthielt. In Ganzzellbiotransformationen mit den Stämmen, die auf der NADP-Abhängigkeit der ADH beruhen, wurden deutlich bessere Ausbeuten erzielt. Das Coexpressionssystem aus ADH und GDH war mit Abstand das beste System; Acetophenon und 2,5 Hexandion konnten vollständig umgesetzt werden. Auch mit den Konstrukten bestehend aus ADH + IDH, ADH + MAE und ADH + AcnB + IDH waren effiziente Ganzzellumsetzungen möglich. Während die Permeabilisierung der Zellmembran keinen wesentlichen Einfluss auf die Umsetzungen hatte, wurden die Ausbeuten nach Zusatz von entsprechendem Cofaktor deutlich erhöht. Die Umsatzraten, die mit den einzelnen Systemen erreicht wurden, korrelieren mit den ADH-Aktivitäten in den jeweiligen Konstrukten. Mit den meisten der in dieser Arbeit entwickelten Ganzzellbiokatalysatoren ist es im Gegensatz zu bisher bekannten Synthesen möglich, im wässrigen System unter moderaten Reaktionsbedingungen chirale Alkohole mit guten Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 2,6 kg Alkohol ∙ L-1 ∙ d-1 mit ee-Werten von 100 % zu produzieren.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	31.01.2005
Dateien geändert am:	08.01.2008
Promotionsantrag am:	27.01.2005
Datum der Promotion:	27.01.2005