Dokument: Development of versatile biocatalysts based on P450 monooxygenases from the CYP154 family

Titel:	Development of versatile biocatalysts based on P450 monooxygenases from the CYP154 family
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30152
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140728-095748-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.-Chem. von Bühler, Clemens-Jeremias [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 15,62 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.07.2014 / geändert 25.07.2014
Beitragende:	Prof. Urlacher, Vlada [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	cytochrome, P450, monooxygenase, CYP154E1, CYP154A8, redox partner, Pdx, PdR, YkuN, FdR, Thermobifida fusca, Nocardia farcinica, Escherichia coli, expression, purification, substrate screening, alkane hydroxylation, whole-cell biotransformation, Grundmann's ketone
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Cytochrom P450 Monooxygenasen sind NAD(P)H-abhängige Hämoproteine, welche die reduktive Spaltung von molekularem Sauerstoff katalysieren. Dabei wird ein Sauerstoffatom zu Wasser reduziert und das andere auf das Substrat übertragen. Die dafür nötigen Reduktionsäquivalente werden von sogenannten Redoxpartnerproteinen auf die Monooxygenase übertragen. An der biokatalytischen Anwendung von P450 Monooxygenasen besteht ein ungebrochenes Interesse, da sie in der Lage sind selbst inerte, nicht-aktivierte Kohlenwasserstoff-Verbindungen zu oxidieren. Derzeit sind über 21000 P450 Gene klassifiziert. Um diesen Sequenzraum als Ressource für neue enzymatische Aktivitäten zu erschließen, sollten in dieser Arbeit neue P450 Enzyme charakterisiert werden. Die bakterielle CYP154-Familie wurde als potentielle Quelle für Biokatalysatoren mit breitem Substratspektrum und hoher Produktselektivität ausgewählt. Das biokatalytische Potential von zwei verschiedenen Familienmitgliedern, CYP154E1 aus Thermobifida fusca YX und CYP154A8 aus Nocardia farcinica IFM 10152, sollte ermittelt werden. Um die Aktivität von P450 Enzymen rekonstituieren zu können, mussten zuerst geeignete Redoxpartnerproteine gefunden werden. Die Untersuchung von autologen Redoxpartnern führte zwar nicht zum Erfolg, die Aktivität beider P450 Enzyme konnte jedoch mit dem heterologen Putidaredoxin (Pdx) und der Putidaredoxinreduktase (PdR) aus Pseudomonas putida und noch effizienter mit dem Flavodoxin YkuN aus Bacillus subtilis und der Escherichia coli Flavodoxinreduktase (FdR) rekonstituiert werden. Um das Substratspektrum und die Produktselektivität der beiden Monooxygenasen charakterisieren zu können, wurde eine neue Durchmusterungsmethode, genannt "Cluster-Screening", entwickelt. Eine Bibliothek aus 51 organischen Molekülen, sortiert nach molekularer Masse und strukturellen Eigenschaften, wurde dafür zusammengestellt. Alle Verbindungen wurden in vitro mit beiden Monooxygenasen getestet und die gebildeten Produkte nach chromatographischer Trennung massenspektrometrisch detektiert. Diese Herangehensweise erlaubt die detaillierte Aufklärung der Regio- und Chemoselektivität der Enzyme. 30 Verbindungen der getesteten Bibliothek wurden von CYP154E1 und 23 von CYP154A8 umgesetzt. Darunter waren hauptsächlich lineare stäbchenförmige Moleküle, wie zum Beispiel Fettsäuren, Alkanole und azyklische Terpenoide. CYP154E1 zeigte generell einen höheren Umsatz. CYP154A8 war im Allgemeinen weniger aktiv, jedoch meist deutlich selektiver und bildete weniger verschiedene Produkte als CYP154E1. Ein Produkt, das von beiden Enzymen gebildet wurde, war 25-Hydroxy-Grundmanns Keton (25-OH-GK), ein Synthesebaustein von Vitamin D3-Derivaten. Das ermittelte Substratspektrum wurde verwendet um eine neue Substratklasse, n-Alkane, für CYP154A8 vorherzusagen. Das Enzym akzeptierte tatsächlich n-Alkane einer Kettenlänge von C7 bis C10. In einem Zwei-Phasen-System konnte, unter Ausnutzung des in situ Extraktionseffekts der organischen Substratphase, eine Regioselektivität für die C2-Position von bis zu 90% beobachtet werden. Ebenso wie die Regioselektivität war auch die Stereoselektivität kettenlängenabhängig. 2-(S)-Alkanole wurden daher mit 63-91% ee gebildet. Die bestimmten TTN-Werte (total turnover number) von bis zu 4400 bestätigten, dass CYP154A8 mit den leistungsfähigsten und etablierten CYP102A1-Systemen konkurrieren kann. Im Gegensatz zu diesen hochgradig evolvierten Muteinen besitzt CYP154A8 als Wildtypenzym bereits eine höhere Regio- und Stereoselektivität als besagte CYP102A1-Varianten. CYP154A8 und CYP154E1 hydroxylierten Grundmanns Keton (GK) absolut regioselektiv an der Position 25, CYP154E1 war dabei jedoch deutlich aktiver (100% vs. 53% Umsatz). 25-OH-GK ist eine wichtige Zwischenstufe für die Herstellung von 25-OH-Vitamin D3-Derivaten. Auf Basis von CYP154E1 sollte eine biokatalytische Alternative zur ineffizienten, chemischen Hydroxylierung von GK entwickelt werden. E.coli-Zellen, die CYP154E1/Pdx/PdR exprimierten, wurden verwendet um Grundmann's Keton umzusetzen. Der Einfluss von Substratkonzentration und -löslichkeit, Produktinhibierung, Sauerstoffeintrag und das alternative Redoxpartnersystem YkuN/FdR wurde untersucht. Unter optimierten Bedingungen war die Herstellung von 1,1 mM (300 mg/L) 25-OH-GK möglich. Im Vergleich zur Fermentation von Amycolata autotrophica zur Produktion von 25-OH-Vitamin D3 war die Endkonzentration von 25-OH-GK mindestens eine Größenordnung höher und wurde in nur einem Fünftel der Zeit erreicht. Die entwickelten Anwendungsbeispiele von Enzymen der CYP154-Familie werden in Zukunft hoffentlich den breiteren Einsatz dieser Enzyme in der Biokatalyse ermöglichen.Um die beobachteten Selektivitäten von CYP154E1 rationalisieren zu können, wurde der Versuch unternommen das Enzym zu kristallisieren. Obwohl die erhaltenen Röntgenbeugungsdaten eine Lösung der Kristallstruktur noch nicht erlaubten, konnte mit der etablierten Kristallisation von CYP154E1 ein erster Schritt zur Bestimmung der 3D-Struktur gemacht werden. Cytochrome P450 monooxygenases (P450s) are NAD(P)H-dependent hemoproteins which catalyze the reductive scission of molecular oxygen leading to one molecule of water and the second oxygen atom being incorporated into a substrate molecule. For this process P450s require reducing equivalents which are transferred by so-called redox partner proteins. The interest in the biocatalytic application of P450s is high because they are able to transfer an oxygen atom on non-activated carbon atoms. To date more than 21000 P450 genes have been classified. To exploit this sequence space as a resource of new oxidation activities, in this study novel P450s should be characterized. The bacterial CYP154 family was selected as potential source of novel P450s with a broad substrate spectrum and a high product selectivity. The biocatalytic potential of two family members, CYP154E1 from Thermobifida fusca YX and CYP154A8 from Nocardia farcinica IFM 10152, was investigated. To reconstitute P450 activity, suitable redox partners had to be identified first. The investigation of autologous redox partners from T. fusca was not successful but catalytic activity of both enzymes could be reconstituted with the heterologous putidaredoxin (Pdx) and putidaredoxin reductase (PdR) from Pseudomonas putida, and even more efficiently with the flavodoxin YkuN from Bacillus subtilis in combination with Escherichia coli flavodoxin reductase (FdR). In order to characterize the substrate spectra and the product selectivities of the reconstituted P450s a method called "cluster screening" was developed. A library of 51 organic molecules clustered into nine groups according to their chemical properties and size was established for screening. Subsequently, the products were separated by chromatography and detected by mass spectrometry. This approach allowed the detailed elucidation of enzyme chemo- and regioselectivity. From the library, 30 compounds were tested positive for CYP154E1 and 23 for CYP154A8. Mainly linear rod shaped molecules have been converted by both enzymes, e.g. fatty acids, alcohols, and acyclic terpenoids. CYP154E1 showed generally a higher degree of conversion whereas CYP154A8 displayed higher product selectivity. The determined substrate spectrum was used to predict a novel substrate class of CYP154A8, namely n-alkanes. The enzyme accepted these substrates with a chain length from C7 to C10. Making use of the in situ product removal effect of a biphasic reaction system, maximal regioselectivity for the C2 position of up to 90% was observed. The stereoselectivity of CYP154A8 was chain length dependent and thus, 2-(S)-alkanols were formed with 63-91% ee. The measured total turnover numbers of up to 4400 confirmed that CYP154A8 can compete with the best performing and well-established CYP102A1-based systems. But unlike those evolved CYP102A1 systems, CYP154A8 wild type shows already higher regio- and stereoselectivity. Both enzymes catalyzed the hydroxylation of Grundmann's ketone at position 25. CYP154E1 and CYP154A8 showed absolute selectivity but conversion was higher with CYP154E1 (100% vs. 53%). 25-Hydroxy-Grundmann's ketone is an important synthetic intermediate for preparation of 25-hydroxyvitamin D3 analogs. Based on CYP154E1 a biocatalytic alternative to the inefficient chemical synthesis of 25-OH-GK was investigated. E. coli cells expressing CYP154E1/Pdx/PdR were used to convert Grundmann's ketone. The influence of various process parameters like substrate concentration and solubility, product inhibition, oxygen supply, and redox partner systems were investigated. By combining all optimized parameters 1.1 mM (300 mg/L) 25-hydroxy-Grundmann's ketone were formed by the CYP154E1/Pdx/PdR system in 24 h. Compared to the fermentation of e.g. Amycolata autotrophica for the production of 25-hydroxyvitamin D3 the resulting concentration of 25-hydroxy-Grundmann's ketone was at least one order of magnitude higher and was reached five times faster. The developed synthetic applications of CYP154-family enzymes and their detailed characterization will hopefully allow the broader application of these enzymes in biocatalysis in the future. In order to rationalize the observed activities and selectivities of CYP154E1 the enzyme was crystallized. Although the obtained X-ray diffraction data have not yet allowed the solution of the crystal structure, with the established crystallization of CYP154E1 a first step to determine its three-dimensional structure was made.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	28.07.2014
Dateien geändert am:	28.07.2014
Promotionsantrag am:	15.05.2014
Datum der Promotion:	23.06.2014