Dokument: Novel steroid reductase from Escherichia coli: from identification and characterization towards the design of a whole-cell biocatalyst
| Titel: | Novel steroid reductase from Escherichia coli: from identification and characterization towards the design of a whole-cell biocatalyst | |||||||
| Weiterer Titel: | Neue Steroid-Reduktase aus Escherichia coli: Von Identifizierung und Charakterisierung bis zur Entwicklung eines Ganzzell-Biokatalysators | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=30053 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20140718-134505-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Tubeleviciute, Agne [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jose, Joachim [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | steroid reductase | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | In this study a novel steroid C20 reductase which catalyzes the regioselective reduction of 11-deoxycorticosterone (11-DOC) into valuable bioactive 20-hydroxysteroid, 4-pregnen-20,21-diol-3-one, was identified in Escherichia coli by protein purification and mass spectrometry. It was demonstrated that a NADH-dependent enzyme encoded by kduD gene and previously described as 2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate 5-dehydrogenase (KduD), catalyzes a regioselective reduction of 11-DOC. It was found that 11-DOC is not involved in the regulation of expression of kduD gene in vivo.
A 6xHis-tagged version of KduD was purified to homogeneity and characterized. It was found to reduce several 20-ketosteroid substrates (11-DOC, 11-deoxycortisol, cortisone, cortisol, corticosterone, 21-hydroxypregnenolone) and the anthracycline derivative doxorubicinone. In addition, KduD was found to accept several polyols as substrates including carbohydrate derivatives, D-gluconate and 5-keto-D-gluconate, as well as 1,2-propanediol. KduD oxidoreductase showed higher affinity for steroid substrates than for carbohydrate derivatives in vitro. The optimal pH for KduD catalyzed reduction of 11-DOC was found to be pH 7.0, whereas it was 9.5 for oxidation of D-gluconate. The optimal temperature for reduction of 11-DOC was found to be 37 ºC. It was shown that KduD does not require metal cofactors for activity. Reducing agents (1 mM 2-ME and 10 mM DTT), fatty acids (1 mM lauric acid and 0.1 mM myristic acid), 10 % ethanol and 0.5 M sodium chloride were found to inhibit the activity of KduD. KduD was identified as a ‘classical’ short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) based on conserved protein sequence motifs. The native form of KduD was proposed to be a homotetramer as indicated by the gel filtration chromatography. The Autodisplay technology turned out to be unsuitable for the design of a KduD whole-cell biocatalyst in E. coli host. The expression of KduD fused to the translocator unit of either AIDA-I or EhaA autotransporter proteins yielded an inactive KduD whole-cell biocatalyst.In dieser Arbeit wurde mittels Proteinaufreinigung und Massenspektrometrie eine neue Steroid C20 Reduktase in Escherichia coli identifiziert, die eine regioselektive, NADH-abhängige Reduktion von 11-Deoxycorticosterone (11-DOC) zum bioaktiven 20-Hydroxysteroid, 4-Pregnen-20,21-diol-3-one, katalysiert. Es wurde gezeigt, dass dieses Enzym durch das kduD Gen kodiert wird und früher als 2-dehydro-3-deoxy-D-Gluconat 5-Dehydrogenase (KduD) bekannt war. Es wurde festgestellt, dass die in vivo Expression des kduD Gens nicht durch 11-DOC beeinflusst wird. Die 6xHis-markierte KduD Oxidoreduktase wurde bis zur Homogenität aufgereinigt und charakterisiert. Sechs 20-Ketosteroid Substrate (11-DOC, 11-Deoxycortisol, Cortison, Cortisol, Corticosteron, 21-Hydroxypregnenolon) und ein Anthracyklin, Doxorubicinon, wurden von diesem Enzym reduziert. Außerdem wurden drei Polyole, darunter die zwei Zucker D-Gluconat und 5-Keto-D-Gluconat, sowie 1,2-Propandiol als neue Substrate der KduD identifiziert. Die KduD Oxidoreduktase zeigte eine höhere Affinität zu Steroiden als zu Kohlenhydratderivaten in vitro. Der optimale pH-Wert für die KduD katalysierte Reduktion von 11-DOC beträgt 7.0, wohingegen für die Oxidation von D-Gluconat ein optimaler pH-Wert von 9.5 bestimmt wurde. Als optimale Temperatur für die Reduktion von 11-DOC wurde 37 ºC festgestellt. Es wurde nachgewiesen, dass für die KduD-Aktivität keine Metall-Cofaktoren erforderlich sind. Durch hohe Konzentrationen an Reduktionsmitteln (1 mM 2-ME und 10 mM DTT), Fettsäuren (1 mM Laurinsäure und 0.1 mM Myristinsäure), Ethanol (10 %) oder Natriumchlorid (0.5 M) wurde die Aktivität von KduD gehemmt. Die KduD Oksidoreduktase wurde als klassische „short-chain“ Dehydrogenase/Reduktase (SDR) auf der Grundlage der konservierten Protein Sequenzmotive erkannt. Entsprechend den Ergebnissen der Gelfiltration scheint das Enzym als Homotetramer vorzuliegen. Die Autodisplay Technologie erwies sich für die Konstruktion eines funktionellen KduD E. coli Ganzzellbiokatalysators als ungeeignet. Wenn die KduD Oxidoreduktase als Fusionprotein mit Hilfe der Translokationseinheit von entweder AIDA-I oder EhaA Autotransporter Protein an der Oberfläche von E. coli exprimiert wurde, war keine Enzymaktivität nachweisbar. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.07.2014 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.07.2014 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 02.06.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.07.2014 |
