Dokument: Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner der 6S RNA aus Escherichia coli und Analyse des 6S RNA Regulationsnetzwerkes

Titel:	Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner der 6S RNA aus Escherichia coli und Analyse des 6S RNA Regulationsnetzwerkes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29982
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140711-085727-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol Schneider, Sabine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 19,54 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.07.2014 / geändert 11.07.2014
Stichwörter:	6S RNA, Escherichia coli, PGK, ppGpp
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Die 6S RNA aus E. coli ist eine stabile regulatorische RNA mit einer charakteristischen hoch konservierten Sekundärstruktur, die sowohl an die σ70-assoziierte RNA-Polymerase als auch an das RNA-Chaperon Hfq bindet. Sie reguliert die Anpassung der Genexpression zwischen der logarithmischen- und stationären Wachstumsphase. Um einen Einfluss des RNA-Chaperons Hfq auf die Expression der 6S RNA aufzuklären, wurden zelluläre 6S RNA Konzentrationsbestimmungen durchgeführt und die ssrSPromotoraktivität in An- und Abwesenheit von Hfq untersucht. In Abwesenheit von Hfq konnte besonders in der logarithmischen Phase eine erhöhte Konzentration an 6S RNA gezeigt werden und im Gegensatz dazu eine erniedrigte ssrS-Syntheseaktivität. Diese Ergebnisse weisen auf ein kompliziertes regulatorisches Netzwerk hin, an dem vermutlich Änderungen der 6S RNA Stabilität beteiligt sind. Um weitere Wechselbeziehungen aufzuzeigen, sollte der globale Regulator ppGpp, der nachweislich mit der Funktion der 6S RNA gekoppelt ist ebenfalls analysiert werden. Messungen des ppGpp-Spiegels haben gezeigt, dass in Abwesenheit von Hfq die basale ppGpp-Konzentration in der Zelle erniedrigt ist. Um den Zusammenhang zwischen der 6S RNA und dem basalen ppGpp-Level genau zu verifizieren, wurden in An- und Abwesenheit von 6S RNA mit Hilfe eines Inhibitors der GMP-Synthetase, der eine Reduktion des GTP-Levels auslösen sollte, exakte Konzentrationsmessungen des ppGpp-Spiegels durchgeführt. Diese Untersuchungen ergaben keine deutlichen Unterschiede, was darauf hin deutet, dass die Wechselbeziehung zwischen der 6S RNA und ppGpp nicht mit dem zellulären GTP-Level in Zusammenhang steht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Suche nach zellulären Interaktionspartnern der 6S RNA durchgeführt. Dazu wurde erfolgreich eine in vitro pull down Methode etabliert und mehrere Proteine gefunden, deren Identität durch MALDI-TOF-Analysen ermittelt wurde. Für das reproduzierbar gefundene Protein PGK (das glykolytische Enzym Phosphoglycerat Kinase) konnte durch in vitro Bindestudien eine RNA-Bindungsaffinität, die 6S RNA, tRNA und pRNA einschließt nachgewiesen werden. ATP-Kompetitionsexperimente legen eine Erkennung der RNA durch die ATP-Bindestelle nahe. Footprint Analysen zeigen eine Bindung von PGK an die einzelsträngige Region der 6S RNA, die central bubble. Durch LCMS- Analysen vom pull down Eluat konnten darüber hinaus einige ribosomale Proteine detektiert werden. Eine direkte Bindung der 6S RNA an 70S Ribosomen ließ sich jedoch durch mehrere in vitro Techniken nicht bestätigen, was eine Bindung an einzelne ribosomale Proteine nicht ausschließt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	11.07.2014
Dateien geändert am:	11.07.2014
Promotionsantrag am:	13.03.2013
Datum der Promotion:	23.06.2014