Dokument: Evaluierung neuer Sicherheits-Biomarker in präklinischen Studien

Titel:	Evaluierung neuer Sicherheits-Biomarker in präklinischen Studien
Weiterer Titel:	Evaluation of new safety biomarkers in preclinical studies
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29941
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140708-114143-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pavkovic, Mira [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,81 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.07.2014 / geändert 07.07.2014
Beitragende:	PD Dr. Vohr, Hans-Werner [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Stichwörter:	Biomarker, microRNA, Organtoxizität
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Substanz-induzierte Organtoxizität in der präklinischen Entwicklung stellt für die zeit- und kostenintensiven Arzneimittelentwicklung eine große Herausforderung dar. Fast die Hälfte aller Arzneimittelkandidaten können aufgrund von diagnostizierter Organtoxizität in präklinischen Versuchstieren nicht weiterentwickelt werden. Die Beurteilung der Toxizität in in vivo Studien erfolgt durch die Messung etablierter Biomarker (BM) und durch die Histopathologie. Der Nachteil Letzterer liegt in der maximalen Invasivität dieser Untersuchungsmethode per se, während die Nachteile vieler etablierter BM in geringer Sensitivität und fehlender Organspezifität liegen. Demnach ist der Bedarf nach neuen nicht-invasiven, sensitiven und spezifischen BM groß, um die Belastung der Versuchstiere während behördlich vorgeschriebener Studien durch schnelleres Erkennen von Organtoxizität zu reduzieren und um Arzneimittel für Patienten durch effizientere Nebenwirkungs-Screening entwickeln zu können. Die vorliegende Arbeit hat das Ziel, zu einer Verbesserung der Detektion bzw. Vorhersage von Organtoxizitäten in präklinischen Studien beizutragen. Da Niere und Leber häufig von Arzneimittel-induzierter Toxizität betroffen sind, wurden mittels Ratten-Toxizitätsmodellen neu-qualifizierte Protein-BM im Urin für Nephrotoxizität re-evaluiert sowie das Potential einer neuen BM-Klasse, der microRNAs (miRNAs) in Urin und Plasma, untersucht. Die Modelle waren: Cisplatin (Cp)-induzierte proximal tubuläre Nierenschädigung, nephrotoxisches Serum (NTS)-induzierte Glomerulonephritis und Methapyrilen (MPy)-induzierte Leberschädigung. Parallel dazu wurde die Gen- und miRNA-Expression in Niere und Leber mechanistisch analysiert. Die Messung neu-qualifizierter BM für Nephrotoxizität im Urin von Cp- und NTS-behandelten Ratten mittels zweier etablierter multiplex Plattformen zeigte, dass, obwohl mit beiden Plattformen ein eindeutiger behandlungsabhängiger BM-Anstieg im Urin messbar war, die absoluten Konzentrationen in den meisten Fällen nicht vergleichbar waren. Demnach konnten keine allgemeingültigen plattformunabhängigen Basallevel identifiziert werden. Jedoch konnten die Vorteile der BM bzgl. Sensitivität und Spezifiität durch ihren relativen Anstieg im Vergleich zu den Kontrollen nachgewiesen werden, da 1) ein Anstieg aller BM in Urin vor der maximalen histologisch diagnostizierten Nekrose nach Cp Behandlung gemessen wurde, 2) die proximaler Tubulus spezifischen BM KIM-1 und αGST bereits am frühesten Untersuchungszeitpunkt nach Cp Behandlung im Urin anstiegen und somit früher als die etablierten Nieren-BM Blut-Harnstoff-Stickstoff und Serum Creatinin, 3) KIM-1 auch nach Verabreichung einer niedrigen, nur geringe Nekrose auslösenden, Cp Dosis im Urin anstieg und 4) kein Anstieg von KIM-1, αGST und anderen BM im Urin von Ratten mit MPy-induzierter Leberschädigung messbar war. Im Hinblick auf miRNAs als potentielle neue BM-Klasse konnte im Urin von Ratten mit Cp- oder NTS-induzierter Nephrotoxizität ein eindeutig verändertes miRNA-Profil nachgewiesen werden, welches hauptsächlich durch einen Anstieg vieler miRNAs gekennzeichnet war. Da keine etablierte Normalisierungsmethode für Urin miRNA PCR-Daten zu Verfügung stand, wurde eine entwickelt, welche den Urin Creatiningehalt als endogenen Parameter der biologischen Variabilität mit einbezieht. Der miRNA-Anstieg im Urin fand, im Vergleich zu etablierten BM, zeitlich früher und auch bei niedrigeren Cp oder NTS Dosen statt. Für die Mehrheit der miRNAs war eine Expression in der Niere bereits beschrieben. Dabei zeigten z.B. miR-21 und -192, die in der Niere von Maus, Ratte und Mensch konserviert exprimiert sind, einen frühen Anstieg nach Cp- und NTS-, aber nicht nach MPy-Behandlung. Aufgrund eines sekundären tubulären Schadens während der NTS-induzierten Glomerulonephritis konnten im Vergleich zur Cp-induzierten proximal tubulären Schädigung keine eindeutig kompartimentspezifischen miRNAs im Urin identifiziert werden. Für miR-10b und -100, welche für die NTS-induzierte Glomerulonephritis potentiell spezifisch waren, konnte eine Lokalisation in den distalen Tubuli identifiziert werden. Auch im Plasma von NTS- oder MPy behandelten Ratten wurde ein eindeutig verändertes miRNA-Profil identifiziert. Insgesamt erschienen viele dieser extrazellulären miRNAs als potentielle BM geeignet zu sein, da sie früh nach der Schädigung in Urin oder Plasma anstiegen und bekannter Weise in der Niere bzw. Leber exprimiert sind. Ferner konnten unter den jeweils behandlungsabhängig deregulierten mRNAs in Niere oder Leber, solche mit im Vergleich zu bestimmten miRNAs entsprechend inversem Expressionsprofil identifiziert werden, deren Regulation durch diese miRNAs schon bekannt ist oder vermutet wird. Dies könnte auf ein Mitwirken der miRNAs an den jeweiligen Toxizitätsmechanismen hinweisen. Drug-induced organ toxicity is one of the major challenges in the context of time and money consuming drug development. Statistically, about one half of the drug candidates are discarded because of drug-induced organ toxicity in preclinical animal species. During in vivo studies toxicity is assessed by measurement of established biomarkers (BMs) and histological examination. The disadvantage of histological examination is the maximal invasive nature whereas the disadvantages of established BMs are related to low sensitivity and organ specificity. Thus, the need for non-invasive, sensitive and specific new BMs is high, in terms of both reducing the suffering of animals during regulatory studies by an earlier detection of organ toxicity and developing necessary drugs for patients including a more efficient screening for adverse effects. Because kidney and liver frequently show drug-induced toxicity, the goal of this thesis was to re-evaluate new urinary protein BMs for nephrotoxicity and to evaluate the potential of microRNAs (miRNAs) in urine and plasma as BMs for nephro- and hepatotoxicity, respectively. Therefore, three rat toxicity models were conducted: cisplatin (Cp)-induced proximal tubular injury, nephrotoxic serum (NTS)-induced glomerulonephritis and methapyrilene (MPy)-induced liver injury. Additionally, gene and miRNA expression in kidney and liver were analyzed for mechanistic insight. Two widely employed multiplex platforms were used for measurement of new protein BMs in urine from Cp- or NTS-treated rats. Although both were able to detect treatment-dependent increases in urine, the absolute concentrations measured were significantly different. Thus platform-independent basal levels could not be defined. With respect to their relative treatment-induced increase the advantages of new BMs concerning higher sensitivity and specificity could be confirmed based on 1) an increase of all new BMs before the maximum of histologically observed necrosis after Cp treatment, 2) an increase of the proximal tubular specific BMs KIM-1 and αGST at the earliest studied time point and thus before an increase of established BMs like BUN or serum creatinine, 3) an increase of KIM-1 after administration of a low Cp dose causing only very mild necrosis and 4) no detectable increase of KIM-1, αGST and others in urine after MPy-treatment. Concerning miRNAs as potential new BM class, significantly changed, mostly increased, miRNA profiles were identified in urine from rats with Cp- or NTS-induced kidney injury. Because of a missing established normalization method for urinary miRNA PCR-data, a new one was developed including urinary creatinine as endogenous reference reflecting biological variability. Urinary miRNAs were found increased earlier and also after administration of lower toxin doses compared to classical BMs. For the majority of the increased miRNAs expression in the kidney was previously reported. Promising BMs are for example miR-21 and -192: They show conserved expression in the kidney in mice, rats and humans and were found here to be increased early in urine after Cp- or NTS-induced kidney injury but not after MPy-induced liver injury. Since NTS-induced glomerulonephritis also caused tubular injury, kidney-compartment-specific miRNAs could not be identified by comparison of urinary profiles from NTS- vs. Cp-treated rats. For miR-10b and -100, being potentially specific for NTS-induced glomerulonephritis, localization was identified in distal tubuli. Significantly changed miRNA profiles were also found in plasma from rats with NTS-induced kidney injury or MPy-induced liver injury. Overall most miRNAs appear as promising BM as they were previously reported to be expressed in liver and/or kidney and were shown here to be increased early after treatment. Furthermore among the treatment-depended deregulated mRNAs in kidney and liver, several could be identified showing an inverse expression compared to miRNAs which are known or predicted regulators of these mRNAs. This suggests a possible involvement of miRNAs in the molecular mechanisms of toxicity.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	08.07.2014
Dateien geändert am:	08.07.2014
Promotionsantrag am:	27.03.2014
Datum der Promotion:	24.06.2014