Dokument: Analyse der wechselseitigen Regulation zwischen Hitzeschockantwort und der zirkadianen Uhr in Säugetieren

Titel:	Analyse der wechselseitigen Regulation zwischen Hitzeschockantwort und der zirkadianen Uhr in Säugetieren
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29909
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140708-084623-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schneider, Rebecca [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,77 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.07.2014 / geändert 03.07.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Reinke, Hans [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Zirkadiane Oszillationen biologischer Prozesse konnten bei allen bisher untersuchten licht-sensitiven Organismen gefunden werden. Diese zirkadianen Rhythmen stellen nicht einfach eine direkte Antwort auf rhythmische Umweltveränderungen dar, sondern werden durch endogene biologische Uhren hervorgerufen. Das zirkadiane System ist eng an den zellulären Metabolismus peripherer Organe gebunden und befähigt Organismen dazu physiologische Prozesse an die jeweilige Tageszeit anzupassen. Beeinträchtigungen zirkadianer Regulati-onsmechanismen können schwerwiegende Einflüsse auf diverse Schutzfunktionen von Zellen haben. Zu den wichtigsten Schutzfunktionen von Zellen gehört unter anderem die Antwort auf proteotoxischen Stress. Durch verschiedene physiologische und pathophysiologische Faktoren, wie erhöhte Temperatur, Schwermetalle, freie Radikale, Entzündungsfaktoren und oxidativer Stress, wird der Transkriptionsfaktor Hitzeschock-Faktor 1 (HSF1) aktiviert und schützt die Zellen von Organismen durch die Initiierung der Transkription von Hitzeschock-Proteinen. Hitzeschock-Proteine gehören zu den molekularen Chaperonen, die für die Auf-rechterhaltung der zellulären Homöostase essentiell notwendig sind. Studien geben Hinwei-se darauf, dass die Hitzeschockantwort in enger Wechselwirkung mit der zirkadianen Uhr von Zellen steht. Über die genauen molekularen Regulationsmechanismen und den Einfluss von Hitzeschock-Proteinen auf die zirkadiane Uhr ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Aus diesem Grund sollte im ersten Teil dieser Arbeit der Einfluss des molekularen Chaperons HSP90 auf die zirkadiane Uhr in Zellen von Säugetieren untersucht werden. HSP90 ist sowohl als Regulator des Hitzeschock-Transkriptionsfaktors HSF1 bekannt, als auch direkt von die-sem reguliert. Es konnte bereits in einigen Studien mit der zirkadianen Uhr in Zusammen-hang gebracht werden. Über seinen Einfluss auf die Regulation des zirkadianen Oszillators in Säugetieren war bis zu diesem Zeitpunkt jedoch nichts bekannt. Um den Einfluss von HSP90 auf die zirkadiane Uhr zu untersuchen, wurde die Aktivität von HSP90 in murinen Fibroblasten pharmakologisch inhibiert. Die Inhibition von HSP90 führte zu einer signifikanten Änderung von Phase und Amplitude der zirkadianen Oszillation. Diese Änderung schien zumindest teilweise auf einer Reduktion der Stabilität der Proteine BMAL1 und CLOCK zu beruhen, die als Heterodimer die Expression der negativen Regulatoren in der zirkadianen Rückkopplungsschleife aktivieren. Die reduzierte Halbwertszeit der Proteine BMAL1 und CLOCK nach Inhibition von HSP90 resultierte in einer verringerten Expression ihrer Zielgene. Durch siRNA (small interfering RNA)-Experimente wurde anschließend nach-gewiesen, dass ausschließlich die zytoplasmatischen Isoformen von HSP90 (HSP90α und HSP90β) an der Stabilisierung des Proteins BMAL1 beteiligt sind. Unter Verwendung eines etablierten Mausmodells für Chronotoxizität konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der Aktivität von HSP90 auch im Tiermodell Einfluss auf Prozesse nimmt, die durch die zirkadiane Uhr reguliert werden. Zusammengefasst haben die in dieser Arbeit durchgeführten Analysen nachgewiesen, dass HSP90 für die korrekte Funktion des zirkadianen Oszillators in Säugetie-ren notwendig ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine transgene Maus hergestellt, die ein Fusionsprotein aus HSF1 und dem TAP (tandem affinity purification)-Tag konditional exprimiert und die Auf-reinigung HSF1-enthaltender Proteinkomplexe aus Mausorganen ermöglicht. In proof of principle Experimenten mit transgenen HSF1-TAP exprimierenden Zelllinien wurde zunächst gezeigt, dass sich C-terminal TAP-gekoppeltes HSF1 hinsichtlich seiner Regulation und transkriptionellen Aktivität wie endogenes HSF1 verhält. Unter Stressbedingungen bildete HSF1-TAP Trimere, akkumulierte im Nukleus und aktivierte die Transkription seines Zielgens Hspa1b. Es war ebenfalls in der Lage mit bekannten Interaktionspartnern zu interagieren. Zusätzlich zu diesen Ergebnissen konnte noch eine Reihe neuer HSF1-Bindungspartner iden-tifiziert werden. Auf der Grundlage dieser Befunde wurde eine transgene HSF1-TAP Knock-in Maus generiert. Erste Analysen haben gezeigt, dass HSF1-TAP endogenes HSF1 in Hsf1-/- Mäusen funktionell ersetzen kann, und dass HSF1 enthaltende Proteinkomplexe aus der transgenen Mauslinie gereinigt werden können. Die neue Mauslinie kann somit für zukünfti-ge Analysen der zirkadianen Regulation von HSF1 und seiner Auswirkungen auf den moleku-laren Oszillator verwendet werden. Circadian oscillations of biological processes are found in virtually all known light-sensitive organisms. These circadian rhythms represent not simply a direct response to rhythmic environmental changes but are caused by endogenous biological clocks. The circadian system is closely linked to the cellular metabolism of peripheral organs and enables organisms to adapt physiological processes to the respective time of day. Impairments of circadian regulatory mechanisms can result in deleterious effects on protective cellular mechanisms. One of the most important protective mechanisms of cells is the response to proteotoxic stress. Physiological and pathophysiological factors, such as increased temperature, heavy metals, free radicals, inflammatory factors and oxidative stress activate the transcription factor heat shock factor 1 (HSF1) which exerts its protective role by transcriptional activation of heat shock genes. Heat shock proteins belong to the family of molecular chaperones which are essential for the maintenance of cellular homeostasis. Previous studies provide evidence that the heat shock system interacts closely with the circadian oscillator. However, little is known about the precise molecular regulatory mechanisms and the influence of heat shock proteins on the circadian clock. In the first part of this work, the role of the molecular chaperone HSP90 in the mammalian circadian clock was examined. HSP90 is a regulator of the heat shock transcription factor HSF1, but it is also under direct transcriptional control of HSF1. Various studies in other model organisms provided evidence that HSP90 is connected to cellular circadian clocks. However, nothing is known about its influence on the circadian oscillator in mammals. In order to investigate the function of HSP90 in the mammalian circadian clock, HSP90 activity was at first inhibited pharmacologically. The inhibition of HSP90 in murine fibroblasts resulted in a significant phase delay and in an amplitude reduction of the circadian oscillator. This impairment seemed at least in part to be due to a reduced stability of the proteins BMAL1 and CLOCK, which activate the expression of genes of the negative arm of the circadian feedback loop. The reduced half-life of BMAL1 and CLOCK resulted in a decreased expression of their target genes. Furthermore, it could be shown in siRNA (small interfering RNA)-mediated knockdown studies that the cytoplasmic isoforms of HSP90 (HSP90α and HSP90β) are involved in the stabilization of BMAL1. By using an established mouse model of chronotoxicity it was demonstrated that inhibition of HSP90 also affects processes that are regulated by the circadian clock in animals. In summary, this work has shown that the function of cytoplasmic HSP90 is required for the correct functioning of the circadian oscillator in mammals. In the second part of this thesis, a transgenic conditionally C-terminally TAP (tandem affinity purification)-tagged HSF1 expressing mouse was generated. In proof of principle experiments using stable transgenic cell lines expressing HSF1-TAP it was demonstrated that regulation and transcriptional activation potential of HSF1-TAP showed the same regulation and function as were comparable to endogenous HSF1. Under stress conditions HSF1-TAP was able to trimerize, to bind to known interaction partners, to translocate to the nucleus and to activate the transcription of its target gene Hspa1b. In addition to these findings several novel binding partners of HSF1 could be identified. Based on these results a transgenic conditionally HSF1-TAP expressing knock-in mouse was generated. First analyses showed that HSF1-TAP could functionally replace endogenous HSF1 in Hsf1-/- mice and that HSF1 containing protein complexes can be purified efficiently from the transgenic mice. Thus the new mouse line can be used for future analyses of the circadian regulation of HSF1 and its effects on the molecular oscillator in mammals.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	08.07.2014
Dateien geändert am:	08.07.2014
Promotionsantrag am:	14.02.2014
Datum der Promotion:	08.05.2014