Dokument: Regulation der Bildung einer extrazellulären Lipase LipA und des Lipase-spezifischen Chaperons LipB in Burkholderia glumae

Titel:	Regulation der Bildung einer extrazellulären Lipase LipA und des Lipase-spezifischen Chaperons LipB in Burkholderia glumae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29848
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140630-085540-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Knapp, Andreas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,12 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.06.2014 / geändert 26.06.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Burkholderia glumae, Lipase, Foldase, Chaperon, LipA, LipB, Regulation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Burkholderia glumae PG1 produziert die biotechnologisch relevante Lipase LipA. Diese wird über den Typ II-Sekretionsapparat in den extrazellulären Raum transportiert. Im Laufe der Sekretion erlangt sie durch Interaktion mit dem im Periplasma lokalisierten Chaperon LipB (Lipase-spezifische Foldase) ihre aktive Konformation. Die Gene der Lipase und der Foldase befinden sich auf einer gemeinsamen transkriptionellen Einheit, dem lipAB-Operon. Mit einem systembiologischen Ansatz wurden hier die zellulären Abläufe in B. glumae PG1 während der Lipaseproduktion in einer Kleinfermenter-Anlage erfasst. Transkriptanalysen zeigten, dass Olivenöl die Transkription des lipAB-Operons induziert. In parallelen Untersuchungen der extrazellulären Metabolite mittels NMR-Spektroskopie konnte nachgewiesen werden, dass Olivenöl als Lipase-typisches Substrat im Kulturüberstand von B. glumae PG1 in Glycerin und freie Fettsäuren zersetzt wird. Freie Fettsäuren werden im Fettsäuremetabolismus durch die β-Oxidation weiter degradiert. Die Inaktivierung eines vermutlich an der β-Oxidation beteiligten Enzyms führte zu einer erhöhten lipolytischen Aktivität. Dies deutet einen bisher unbekannten regulatorischen Zusammenhang zwischen der β-Oxidation und der Lipaseproduktion an, der zur Optimierung der Lipaseproduktion genutzt werden kann. Die Analyse des Transkriptoms zeigte, dass während der durch Olivenöl induzierten Lipaseproduktion mindestens 90 Gene eine veränderte Transkriptmenge aufweisen, von denen 12 für Transkriptionsregulatoren kodieren. Einer dieser Regulatoren ist der Transkriptionsaktivator RhlR. Dieser wird unter Lipase-induzierenden Bedingungen verstärkt synthetisiert und stimuliert die Bildung von Rhamnolipiden. Rhamnolipide finden als Biotenside ebenfalls Verwendung in der Industrie. Hier konnte gezeigt werden, dass B. glumae PG1 mit der Lipase und den Rhamnolipiden zeitgleich zwei biotechnologisch relevante Moleküle produziert. Die in dieser Arbeit etablierten Strategien zur heterologen Expression zeigten außerdem, dass B. glumae PG1 nicht nur zur Lipaseproduktion, sondern auch zur Produktion heterologer Proteine eingesetzt werden kann. Die Gewinnung der Lipase für die biotechnologische Anwendung setzt eine effiziente Sekretion in den extrazellulären Raum voraus. Durch Analyse des extrazellulären Proteoms konnten in dieser Arbeit neben der Lipase weitere Proteine identifiziert werden, die ebenfalls über den Typ II-Weg sekretiert werden und als mögliche Konkurrenzsubstrate ein lohnendes Ziel für weitere Stammoptimierungen darstellen. Zudem konnte erstmals ein Rückkopplungseffekt des Sekretionsapparates auf die Regulation der Lipaseproduktion charakterisiert werden. Dabei inhibiert ein unvollständiger Typ II-Sekretionsapparat die Transkription des lipAB-Operons. Eine verstärkte Synthese der Sekretionspore GspD hingegen führt durch diesen Rückkopplungseffekt zu einer Steigerung der Lipaseproduktion. Weiterhin zeigte eine Analyse des lipAB-Operons aus dem Lipase-überproduzierenden Derivat B. glumae Lu8093, dass ein Aminosäureaustausch im Signalpeptid der Lipase deren Sekretion verbessert. In Verbindung mit einer transkriptionsverstärkenden Mutation im lipAB-Promotor hat dieser Aminosäureaustausch einen synergetischen Effekt auf die Steigerung der extrazellulären Lipasemenge. Über die komplexe Regulation des lipAB-Operons ist bisher nur wenig bekannt. Mithilfe von DNA-Protein-Interaktionsstudien konnte der LysR-ähnliche Transkriptionsregulator BGL_1c34440 in vitro als putativer Repressor des lipAB-Operons identifiziert werden. Bislang wurde vermutet, dass die Foldase in einem katalytischen Mechanismus mehrere Lipasemoleküle nacheinander aktivieren kann. In dieser Arbeit durchgeführte Proteinmengenanalysen untermauern diese Hypothese, da bei steigender Menge extrazellulärer Lipase LipA die Menge der intrazellulären Foldase LipB konstant bleibt. Zudem konnte hier erstmals der dafür verantwortliche posttranskriptionelle Regulationsmechanismus des lipAB-Operons charakterisiert werden: Studien mit transkriptionellen Reportergenfusionen sowie Transkriptanalysen mittels PCR und RNA-Sequenzierung zeigten, dass ein gemeinsames lipAB-Transkript spezifisch im lipB-Bereich degradiert wird. Durch diese Degradation wird die Proteinbiosynthese der Foldase unabhängig von der Lipaseproduktion verhindert. Die vorliegende Arbeit konnte also (i) einen lange Zeit nicht verstandenen Regulationsmechanismus des lipAB-Operons aufklären und (ii) durch die detaillierte Charakterisierung der Lipaseregulation und -sekretion eine Reihe von Optimierungsoptionen für die Lipaseproduktion in B. glumae PG1 aufzeigen. Burkholderia glumae PG1 produces a biotechnological relevant lipase LipA. This lipase is transported to the extracellular space via the type II secretion pathway. Its active conformation is achieved by interaction with the periplasmatic chaperone LipB (lipase-specific foldase) during the secretion process. Both genes, lipase and foldase, are located in a transcriptional unit called lipAB operon. The use of small-scale bioreactors allowed a detailed analysis of the cellular processes in B. glumae PG1 under lipase producing conditions. Transcript analysis revealed that olive oil (a typical lipase substrate) induces the transcription of the lipAB operon. The profiling of extracellular metabolites by NMR spectroscopy confirmed that olive oil is decomposed into glycerol and free fatty acids. Free fatty acids are degraded by β-oxidation in the fatty acid metabolism. Interestingly, the inactivation of an enzyme presumably involved in the β-oxidation is able to increase lipolytic activity. This indicates a previously unknown regulatory relationship between the β-oxidation and the lipase production which can be used to optimize the production of the lipase. Expression profiling identified more than 90 genes with an altered transcription profile during olive oil induced lipase production. Twelve of them encode for transcriptional regulators. One of these regulators is the transcriptional activator RhlR. Its biosynthesis is increased under lipase inducing conditions and activates the formation of rhamnolipids. Rhamnolipids find increasing application as biotensids in industrial biotechnology. Here, it was demonstrated that B. glumae PG1 produces two biotechnological relevant compounds (lipase and rhamnolipids) simultaneously. Furthermore, heterologous expression strategies established in the presented thesis proved that B. glumae PG1 is suitable not only for lipase production but also for the synthesis of heterologous proteins. The downstream processing of lipase for biotechnological application requires its efficient secretion into the extracellular space. Besides the lipase, secretomics identified several proteins that are also secreted via the type II pathway. As possible concurrence substrates they appear as promising targets for further strain optimization. Moreover, a feedback effect of the secretion pathway on the regulation of the lipase production could be characterized for the first time. Herein, a damaged type II secretion system inhibits the lipAB transcription while an increased synthesis of the secretion pore GspD leads to an enhanced lipase production. In addition, a lipAB operon originating from the lipase-overproducing strain B. glumae Lu8093 was analyzed. It was shown that a single amino acid replacement in the signal peptide of the lipase enhances the lipase secretion. Combined with a mutation that increases the lipAB transcription rate, this replacement increases the amount of extracellular lipase in a synergistic way. At present, only little is known about the complex regulation of the lipAB operon. DNA-protein-interaction studies identified a LysR-type transcriptional regulator BGL_1c34440 in vitro as a putative repressor of the lipAB operon. It was supposed that a single foldase is able to activate several molecules of lipases by a catalytical mechanism. Quantitative protein assays performed in the present work support this hypothesis. With increasing amount of extracellular lipase LipA, the amount of intracellular foldase LipB remains constant. Here, the underlying regulatory mechanism acting on a posttranscriptional level was characterized: studies with transcriptional reporter fusion as well as transcript analysis by PCR and RNA sequencing demonstrated that a combined lipAB transcript is degraded specifically at a defined region within lipB. This degradation inhibits the foldase biosynthesis without affecting the lipase production. In conclusion, the presented work (i) solved a regulatory mechanism of the lipAB operon which was not understood so far and (ii) highlighted several targets for the optimization of lipase production in B. glumae PG1 by a detailed characterization of lipase regulation and secretion.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	30.06.2014
Dateien geändert am:	30.06.2014
Promotionsantrag am:	06.02.2014
Datum der Promotion:	08.04.2014